動(dòng)物源大腸桿菌GyrA突變與喹諾酮類藥物耐藥性的因果關(guān)系：基于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的研究.pdf

1、喹諾酮類抗菌藥作為一種廣譜抗生素，是人畜通用的藥物，隨著使用頻率越來越高，細(xì)菌對(duì)其耐藥性逐漸增強(qiáng)，耐藥菌株呈現(xiàn)迅速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了喹諾酮類藥物在臨床上的治療效果。目前中國(guó)的大腸桿菌等革蘭氏陰性菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率顯著高于其他國(guó)家。大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制有很多種，如作用靶位點(diǎn)和編碼基因的改變、攜帶質(zhì)粒耐藥基因、細(xì)胞膜通透性改變、藥物主動(dòng)外排泵的作用等，其中起主導(dǎo)作用的是作用靶位點(diǎn)和編碼基因的改變。在靶位點(diǎn)的改變中回旋酶

2、和拓樸異構(gòu)酶Ⅳ的特定突變會(huì)使得大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥的耐藥性增強(qiáng)。而目前的研究主要是針對(duì)喹諾酮耐藥相關(guān)性的，對(duì)其因果關(guān)系的研究較少。本研究首先對(duì)580株臨床分離的大腸桿菌進(jìn)行萘啶酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥檢測(cè)，并對(duì)其gyrA突變基因進(jìn)行檢測(cè)，從而分析其耐藥相關(guān)性。再利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究大腸桿菌gyrA基因突變與喹諾酮耐藥的因果關(guān)系。
　　一、GyrA基因突變與喹諾酮類耐藥相關(guān)性研究

3、>　　本研究采用世界衛(wèi)生組織推薦的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，按CLSI(2012)判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)大腸桿菌對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星這3種喹諾酮類藥物的敏感性，以分析大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率的情況。結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥率非常高，580株臨床大腸桿菌樣品對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的耐藥率分別為75.34％(437/580)、47.07％(273/580)和48.62％(282/580)，說明臨床分離的大腸

4、桿菌對(duì)喹諾酮的耐藥程度較強(qiáng)。利用熒光定量PCR及基因測(cè)序的方法，檢測(cè)580株臨床大腸桿菌樣品中g(shù)yrA基因突變情況。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gyrA基因上第248、255、259、260、261、273、300位堿基發(fā)生突變。依照遺傳密碼子表，確定突變基因相應(yīng)氨基酸改變，發(fā)現(xiàn)只有第83位氨基酸和87位氨基酸發(fā)生改變，而第255、273、300位堿基為無意義突變。本研究發(fā)現(xiàn)第83位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，?7位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)樘於?/p>

5、酰胺、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸。其中突變率最高的為83Ser→Leu與87Asp→Asn同時(shí)突變，突變率達(dá)49.3％。在喹諾酮耐藥率方面，83Ser→Leu與87Asp→Asn同時(shí)突變的耐藥率也是最高的，說明其耐藥相關(guān)性強(qiáng)。
　　二、基于CRISPR/Cas9技術(shù)研究大腸桿菌GyrA基因突變與喹諾酮類藥物耐藥性因果關(guān)系
　　利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌ATCC25922的gyrA基因進(jìn)行突變，以及對(duì)大腸桿菌臨床株進(jìn)

6、行反向突變，從而研究大腸桿菌gyrA基因突變與喹諾酮耐藥的因果關(guān)系。由于gyrA基因中與喹諾酮耐藥相關(guān)性較大的氨基酸位點(diǎn)為83和87位點(diǎn)，故利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株gyrA基因的第248位點(diǎn)和259位點(diǎn)進(jìn)行突變，對(duì)大腸桿菌臨床株248位點(diǎn)進(jìn)行突變。最終獲得突變株E.coliATCC25922 S83L（標(biāo)準(zhǔn)株氨基酸83由絲氨酸變?yōu)榱涟彼幔?、E.coli ATCC25922 D87Y（標(biāo)準(zhǔn)株氨基酸87由天冬氨酸變?yōu)槔?/p>

7、氨酸）、E.coliATCC25922 S83L&D87N（標(biāo)準(zhǔn)株氨基酸83和87分別由絲氨酸變?yōu)榱涟彼岷吞於彼嶙優(yōu)樘於０罚?、E.coli S462231 L83S（臨床株氨基酸83由亮氨酸變?yōu)榻z氨酸）。并利用生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)和藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)突變株進(jìn)行喹諾酮耐藥性分析，結(jié)果表明，gyrA基因突變與喹諾酮耐藥存在因果關(guān)系。
　　綜上所述，本研究對(duì)580株臨床分離大腸桿菌進(jìn)行喹諾酮耐藥性檢測(cè)，并研究gyrA基因突變與耐藥