飼料源無機(jī)銅和抗生素對動物腸道大腸桿菌耐藥性的影響.pdf

1、細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)引起世界各地的廣泛關(guān)注，規(guī)范合理使用抗生素已迫在眉睫。雖然歐盟已經(jīng)禁止將部分抗生素作為生長促進(jìn)劑添加在動物飼料中，但是細(xì)菌耐藥性并沒有因此消失，一方面是原因是抗生素仍是治療動物疾病的主要用藥，另一方面，飼料高銅可能對細(xì)菌耐藥性存在一定的協(xié)同作用。細(xì)菌在動物腸道這個復(fù)雜的環(huán)境中，面對重金屬和抗生素的雙重壓力，很容易對二者產(chǎn)生抗性，那么細(xì)菌對重金屬抗性及耐藥性之間是否存在聯(lián)系？如果存在，那么具體聯(lián)系如何？撤除飼料中的抗生素

2、和無機(jī)銅能否緩解細(xì)菌的耐藥性和重金屬抗性呢？本論文擬圍繞上述三個關(guān)鍵問題開展深入系統(tǒng)研究，試驗分為三個部分:
　　試驗一不同銅水平日糧對頭孢噻呋處理的大鼠糞源大腸桿菌耐藥性的影響
　　本試驗旨在研究不同銅水平日糧和頭孢噻呋對腸道中大腸桿菌銅抗性水平和耐藥性的影響，并對耐藥菌進(jìn)行抗性基因檢測及ERIC PCR指紋圖譜分型，探討銅和頭孢噻呋在腸道大腸桿菌耐藥性形成過程中的協(xié)同關(guān)系。試驗以30只雄性SD大鼠為試驗?zāi)Ｐ?，根?jù)無銅基礎(chǔ)

3、日糧中銅的添加水平將其隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為缺乏組（D組，銅添加量:0 mg·kg-1），對照組（C組，銅添加量6 mg·kg-1）以及臨界組（M組，銅添加量:240 mg·kg-1）。預(yù)飼1周C組日糧后，所有動物根據(jù)組別分組飼喂8周，構(gòu)建不同銅水平下的動物模型。隨后，在原有分組基礎(chǔ)上將上述3組又分為試驗組和對照組，共6組。試驗組大鼠連續(xù)灌喂6天治療劑量（10 mg·kg-1）鹽酸頭孢噻呋，對照組灌喂同等體積食用油，停止灌藥，

4、繼續(xù)分組飼喂不同銅水平日糧。分別采集29，50，84，93，99，113，127日齡新鮮糞便樣品，分離并鑒定大腸桿菌。采用CLSI推薦的瓊脂稀釋法，對分離株進(jìn)行抗生素和銅敏感性檢測。并對分離的耐藥菌進(jìn)行抗性基因檢測和ERIC PCR指紋圖譜分型。結(jié)果表明:抗生素使用前，不同銅水平日糧對大鼠糞源大腸桿菌的銅抗性和耐藥性沒有顯著影響。灌喂6天治療劑量的鹽酸頭孢噻呋后，M-CTO組分離的耐藥菌數(shù)目顯著增加(P＜0.05)，C-CTO組的高耐銅

5、率顯著高于其對照組及抗生素使用前的C-CTO組(P＜0.05)。綜上所述，在頭孢噻呋的介入下，飼料高銅對耐藥菌數(shù)目的增加具有促進(jìn)作用。
　　試驗二定量分析頭孢噻呋處理前后各銅水平組大鼠糞樣blaCTX-M-9基因變化
　　本試驗旨在研究頭孢噻呋處理前后，不同銅水平組大鼠糞源耐藥基因的攜帶情況，并通過定量分析耐藥基因水平變化，探討抗生素和銅對細(xì)菌耐藥性形成的影響。本研究依據(jù)上一章的動物試驗設(shè)計，對試驗前期和試驗期各組大鼠糞樣3

6、種耐藥基因進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，并通過定量PCR分析blaCTX-M-9耐藥基因的水平變化?；虺Ｒ?guī)檢測結(jié)果表明:29d（預(yù)飼1周C組日糧后），D、C、M各組均檢測到不同程度的耐藥基因攜帶情況;84d（分組飼喂日糧8周后），檢測到的陽性樣本數(shù)減少;93d（灌喂6天抗生素后），陽性樣本數(shù)增加。定量分析各時間點(diǎn)blaCTX-M-9耐藥基因水平變化:29d，M組對照組的耐藥基因水平極顯著高于其試驗組(CTO)(P＜0.01)，D、C-CTO組與

7、其對照組之間無顯著差異;93d，各CTO組的耐藥水平顯著升高(P＜0.05);99d（休藥1周后），各CTO組的耐藥水平均顯著下降(P＜0.05);113 d（休藥3周后），各CTO組耐藥水平顯著低于93 d(P＜0.05)，并且，M-CTO組的耐藥水平顯著高于D-CTO組(P＜0.05)。綜上所述，頭孢噻呋的使用對不同銅處理組大鼠糞樣blaCTX-M-9耐藥基因水平變化存在顯著影響，高銅對耐藥基因的維持可能起到一定促進(jìn)作用。
　

8、　試驗三撤除教槽料抗生素和無機(jī)銅對哺乳仔豬糞便大腸桿菌耐藥性的影響
　　本試驗旨在通過比較采食商品教槽料（含抗生素和無機(jī)銅）和自配教槽料（不添加抗生素和無機(jī)銅）蘇淮哺乳仔豬糞便中氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、頭孢噻肟(CTX)耐受腸桿菌數(shù)的差異和分離自CTX-Mac平板大腸桿菌耐藥性的變化，剖析和探討撤除飼料中的抗生素和無機(jī)銅對緩解豬源大腸桿菌耐藥問題的可行性與意義。選用9窩27頭7日齡哺乳仔豬，隨機(jī)分為3組，每組3窩9頭

9、仔豬，從14日齡開始W0組飼喂商品教槽料，W1和W2組飼喂不同的自配教槽料，30日齡斷奶，采集每頭仔豬7日齡和30日齡的糞樣，進(jìn)行Mac平板和TET、AMP、CTX-Mac平板計數(shù)，并用瓊脂稀釋法檢測分離自CTX-Mac平板大腸桿菌的多種抗生素和銅MIC值。結(jié)果顯示:7日齡時，各組仔豬糞樣的腸桿菌數(shù)以及AMP、TET、CTX耐受腸桿菌數(shù)均無顯著差異;30日齡時，W1組的AMP耐受、W2組TET耐受腸桿菌數(shù)顯著低于W0組(P＜0.05)，

10、W1和W2組CTX耐受腸桿菌數(shù)及其比例均極顯著低于W0組(P＜0.01)。除1株外所有的大腸桿菌均對TET和AMP耐藥，約45％的大腸桿菌耐受氟苯尼考(FLO)，約15％的大腸桿菌耐受環(huán)丙沙星(CIP)，并不受教槽料中抗生素和無機(jī)銅撤除與否的影響。大腸桿菌對慶大霉素(GEN)和萘啶酸(NAL)的敏感性表現(xiàn)出一定程度的此消彼長趨勢，對NAL敏感性的降低伴隨著對GEN敏感性的升高。30日齡時，W0組大腸桿菌的銅抗性顯著高于W1和W2組，菌株