大腸桿菌的乳酸亞致死性損傷及修復研究.pdf

1、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）是與我們?nèi)粘Ｉ铌P系非常密切的一類細菌，它廣泛存在于土壤表層、水體、家畜、家禽、蚊蠅以及肉類、乳與乳制品、水產(chǎn)品、豆制品、蔬菜、發(fā)酵食品等各種食品中。大腸桿菌在面對一些不利環(huán)境，如酸、堿、加熱、低溫、干燥、抗菌肽等，很可能形成獨特的生理狀態(tài)——亞致死性損傷狀態(tài)。亞致死性損傷大腸桿菌難以徹底消除，會造成極大的食品安全隱患，已引起高度重視，成為近年來的研究熱點。而乳酸本身具有抑菌

2、作用，也可與其他防腐劑產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用，已經(jīng)廣泛應用于食品領域；奶酪、酸奶、蛋黃醬等乳酸菌發(fā)酵食品中也有大量的乳酸存在；另外，腸道中的益生菌——乳酸菌，能通過分泌大量乳酸來抑制腸道中的大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的生長。乳酸亞致死性損傷大腸桿菌可能廣泛存在于這些環(huán)境中。但是，目前對大腸桿菌的監(jiān)控多數(shù)處于活菌研究狀態(tài)，亞致死性損傷大腸桿菌的檢測已經(jīng)成為食品安全檢測的熱點和難點之一。因此，掌握大腸桿菌在乳酸脅迫情況下的生物學特性以及其亞致死性損傷

3、狀態(tài)的修復機制，為食品加工工業(yè)控制大腸桿菌的污染提供新的認識，對發(fā)展更加可靠的檢測技術具有重要意義。
　　本論文以食品及腸道中的常見菌——大腸桿菌為研究對象，首先研究乳酸亞致死性損傷大腸桿菌的產(chǎn)生情況及修復規(guī)律，考察乳酸亞致死性損傷程度與細胞膜通透性的關系，然后測定大腸桿菌在氧化應激代謝途徑中的ROS水平、SOD及CAT活性、總谷胱甘肽含量的變化趨勢，比較氧化應激基因缺陷株與野生株的培養(yǎng)基修復速率比，篩選緩解氧化應激途徑中的修復調(diào)

4、控基因。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）研究了不同pH值的乳酸溶液、溫度、需氧量對大腸桿菌亞致死的影響。結(jié)果表明，不同pH值的乳酸對大腸桿菌亞損傷有極顯著影響（P＜0.01），當pH≥5.50，乳酸溶液不會導致大腸桿菌亞損傷；當pH≤3.00，大腸桿菌直接致死；當乳酸pH值為3.00-5.40，極可能存在乳酸亞致死性損傷大腸桿菌。乳酸亞損傷大腸桿菌的較佳制備條件為：37℃，125 r/min，乳酸pH值4.20，處理時間為60 mi

5、n，最大亞致死率為99.15％。乳酸處理會導致大腸桿菌內(nèi)含物外滲以及細胞膜的損傷，而且乳酸亞損傷程度與細胞膜通透性成正相關。在較佳制備條件下，大腸桿菌的細胞膜通透性變化率為92.91%。
　?。?）研究了rpoS、rssB、uvrY、phoQ、arcA等感應基因的缺失對大腸桿菌耐酸性的影響。結(jié)果表明，rpoS、rssB、uvrY、phoQ的缺失造成大腸桿菌的耐酸性下降，在60 min時，相應的缺陷株的亞致死率分別為：99.66%、

6、99.10%、99.62%、100%；然而，arcA基因的缺失增強了大腸桿菌的耐酸能力，ΔarcA在60 min時的亞致死率為97.98%。
　　(3)研究了修復溫度、營養(yǎng)、外源添加物等多種因素對乳酸亞致死性損傷大腸桿菌修復的影響。結(jié)果表明，最佳修復溫度為37℃，而在4℃條件下?lián)p傷大腸桿菌無法完成修復；損傷大腸桿菌的修復需要一定的營養(yǎng)條件，營養(yǎng)越豐富，修復率越快；外源添加物中，CAT、Zn2+、Mn2+、Fe2+對損傷大腸桿菌的修

7、復都有顯著性影響（P＜0.05），而且1 mmol/L低濃度的Zn2+、Mn2+、Fe2+均對乳酸亞損傷大腸桿菌的修復起作用。乳酸亞損傷大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)基修復后，細胞膜也同時得到修復。
　?。?）測定了大腸桿菌在乳酸亞損傷過程及修復過程中的ROS水平、SOD及CAT的活力和總谷胱甘肽的含量。研究表明，大腸桿菌在乳酸亞損傷過程中會發(fā)生氧化應激，最大損傷程度時，損傷菌的ROS水平是正常菌的4.59倍；損傷菌完成修復后，其體內(nèi)的ROS水平

8、會下降到正常水平；發(fā)現(xiàn)，CAT是通過直接清除ROS和促進提高大腸桿菌內(nèi)源CAT活力的方式來緩解氧化應激；Zn2+、Mn2+、Fe2+是通過提高大腸桿菌內(nèi)源SOD活力的方式來緩解氧化應激。
　　（5）研究了sodA/B/C、katG/E、gshA/B等氧化應激基因的缺失對大腸桿菌耐酸性的影響。結(jié)果表明，sodA/B/C、katG/E、gshA/B的缺失造成大腸桿菌的耐酸性下降，在60 min時，相應的缺陷株的亞致死率分別為：99.2

9、8%、99.16%、99.47%、99.50%、99.54%、99.16%、99.13%。發(fā)現(xiàn)在清除ROS效果方面，Cu/ZnSOD、MnSOD比FeSOD更有效。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在面對乳酸脅迫環(huán)境時，不僅會發(fā)生乳酸亞致死性損傷，還伴隨著氧化應激反應，產(chǎn)生大量活性氧，改變細胞膜通透性。乳酸亞致死性損傷大腸桿菌的較佳制備條件為：37℃，125 r/min，乳酸pH值4.20，處理時間為60 min，最大亞致死率為99

10、.15%。大多數(shù)金屬離子能促進亞損傷菌的修復，特別是低濃度（1 mmol/L）的Zn2+、Mn2+、Fe2+對損傷大腸桿菌的修復都有顯著性影響（P＜0.05）。rpoS是總調(diào)控基因，對大腸桿菌的耐酸性不可缺少，而arcA的表達會抑制大腸桿菌的耐酸性。SOD、CAT作為大腸桿菌主要的抗氧化酶系，在其緩解氧化應激和提高耐酸性方面起著無可替代的作用。
　　本論文是國家自然科學基金--《乳酸亞致死性損傷大腸桿菌修復相關基因及信號傳導的研究