超高壓致大腸桿菌O157-H7損傷后的修復(fù)機(jī)理研究.pdf

1、超高壓技術(shù)作為一種非熱殺菌技術(shù)，已成為控制食品中大腸桿菌O157∶H7等食源性致病菌的有效手段。然而，研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生亞致死損傷，由于菌體特性改變導(dǎo)致其在常規(guī)檢測(cè)中易被低估或忽視，故亞致死損傷菌的存在給食品的安全及貨架期帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。前入較多研究超高壓對(duì)微生物的致死效應(yīng)，而對(duì)超高壓誘導(dǎo)微生物損傷后的修復(fù)研究少見(jiàn)報(bào)道，因此本論文旨在研究超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在無(wú)營(yíng)養(yǎng)的磷酸鹽緩沖液PBS中的修復(fù)情況。本論文首先采

2、用不同壓強(qiáng)對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行超高壓處理，確定出產(chǎn)生損傷菌較多的超高壓條件，接著對(duì)此條件下所產(chǎn)生的損傷菌以PBS為基質(zhì)于不同溫度下進(jìn)行修復(fù)，確定亞致死損傷菌的最佳修復(fù)條件;進(jìn)而，在最佳修復(fù)條件下研究修復(fù)過(guò)程中損傷菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、生理特征分析、基因表達(dá)的變化等來(lái)闡明大腸桿菌O157∶H7超高壓損傷后的修復(fù)機(jī)理。本研究將為實(shí)際生產(chǎn)加工中超高壓的科學(xué)合理使用提供依據(jù)，為超高壓處理后的安全貯藏提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估手段。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:<

3、br>　　1、損傷的大腸桿菌O157∶H7不同溫度下的修復(fù)曲線
　　大腸桿菌O157∶H7分別采用100、200、300、400、500 MPa(25℃、5 min)進(jìn)行超高壓處理，采用選擇性培養(yǎng)基SMAC和非選擇性培養(yǎng)基TSA進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，隨著壓強(qiáng)升高，滅活效果越好，但是損傷效應(yīng)與致死效應(yīng)并不一致。大腸桿菌O157∶H7在400 MPa條件下處理5 min，亞致死損傷率最高。進(jìn)一步將400 MPa超高壓處理后的大腸

4、桿菌O157∶H7分別置于20、25、30、37℃下，以PBS作為基質(zhì)進(jìn)行修復(fù)研究，結(jié)果表明隨著修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，損傷菌分別在60h(20℃)、24h(25℃)、36h(30℃)、48 h(37℃)基本修復(fù)，最終確定損傷的大腸桿菌O157∶H7的最適修復(fù)溫度為25℃，修復(fù)24 h時(shí)基本完成修復(fù)。
　　2、損傷的大腸桿菌O157∶H7修復(fù)過(guò)程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化
　　在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，400 MPa超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在無(wú)

5、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)PBS中25℃修復(fù)24 h，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察超高壓損傷菌在不同修復(fù)階段下表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。掃描電鏡結(jié)果表明，超高壓可導(dǎo)致菌體表面凹陷、細(xì)胞膜破裂、變形等形態(tài)異常，但隨著修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，損傷菌表面逐漸變光滑，修復(fù)18h、24 h后菌體形態(tài)顯著改善，最終基本恢復(fù)為正常菌。透射電鏡結(jié)果表明，超高壓可導(dǎo)致菌體細(xì)胞變形、質(zhì)壁分離、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)光透明區(qū)、細(xì)胞膜破裂等變化，但隨著修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，透明區(qū)域逐漸消失，至

6、實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趽p傷菌的結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)為正常菌。
　　3、損傷的大腸桿菌O157∶H7修復(fù)過(guò)程中生理特性的變化
　　400 MPa超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在PBS中25℃修復(fù)24 h，研究超高壓損傷菌在不同修復(fù)階段下Na+、K+、Ca2+、Mg2+離子外泄量、細(xì)胞膜Na+K+-ATP酶活性和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、細(xì)胞膜通透性、可溶性膜蛋白組成及膜脂肪酸組成等生理特性方面的變化。結(jié)果表明，超高壓處理可對(duì)大腸桿菌O15

7、7∶H7細(xì)胞膜生理特性造成嚴(yán)重破壞，各指標(biāo)與未經(jīng)超高壓處理的對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P＜0.05)。修復(fù)過(guò)程中，隨著修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，各離子外泄量、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、細(xì)胞膜通透性、可溶性蛋白組成、脂肪酸組成的變化逐漸趨向正常細(xì)胞水平，表明損傷的菌體生理特性發(fā)生修復(fù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谛迯?fù)24 h時(shí)與正常未處理組仍存在顯著性差異(P＜0.05)，這主要與體系中存在一定量不可逆損傷和死亡細(xì)菌有關(guān)。
　　4、損

8、傷的大腸桿菌O157∶H7修復(fù)過(guò)程中差異基因的表達(dá)
　　采用Real-time PCR相對(duì)定量的方法分析400 MPa超高壓誘導(dǎo)大腸桿菌O157∶H7損傷后修復(fù)過(guò)程中熱休克蛋白相關(guān)基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表達(dá)量變化。結(jié)果表明，超高壓處理后四種熱休克蛋白相關(guān)基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表達(dá)量均顯著上升(p＜0.05)，修復(fù)過(guò)程中四種基因表達(dá)量仍逐漸上升，且修復(fù)后期顯著高于修復(fù)初期(p＜0.05)，