大腸桿菌O157-H7效應(yīng)分子NleF的初步研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是一種重要的革蘭氏陰性腸道致病菌，其血清型O157∶H7曾多次引起廣泛的爆發(fā)流行，目前已成為全球性公共衛(wèi)生問題。EHEC為具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢ secretionsystem，T3SS)的胞外寄生菌，主要通過將其Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白注入胞內(nèi)，發(fā)揮致病性和進(jìn)行毒力傳播。目前經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的效應(yīng)蛋白共有39個(gè)，其中NleF是功能和細(xì)胞

2、內(nèi)靶標(biāo)尚不清楚的效應(yīng)分子之一。
　　NleF蛋白相對(duì)分子量為21.4kD，其基因z6020位于EHEC O157∶H7基因組的O-71毒力島上。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，z6020的序列與腸致病性大腸桿菌EPEC的nleF完全一致，與鼠檸檬酸桿菌的nleF具有89％的相似性。前期研究表明，與野生型相比，NleF缺失的鼠檸檬酸桿菌感染小鼠后，其定植能力顯著降低。這提示我們NleF可能是EHEC重要的毒力因子，研究其蛋白功能對(duì)于探索EHE

3、C的致病機(jī)制具有重要意義。
　　本研究中，我們利用經(jīng)典的λ-Red同源重組和重疊延伸PCR的方法，擴(kuò)增了融合有z6020基因上下游同源臂和卡那霉素抗性基因kan的重組DNA片段，將其電擊轉(zhuǎn)入含pKD46的EDL933感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了以kan基因置換nleF的敲除菌株，隨后將pCP20輔助質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入含有kan片段的敲除菌株感受態(tài)細(xì)胞中，通過抗性篩選及測(cè)序鑒定，構(gòu)建了去除kan片段的nleF基因敲除菌株ΔnleF。同時(shí)，我們以E

4、DL933基因組為模板，擴(kuò)增了z6020基因，將其連接至pET-24a(+)載體，電擊轉(zhuǎn)入敲除菌株ΔnleF感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了回復(fù)突變菌株ΔnleF/NleF。
　　為了研究NleF對(duì)EHEC生長(zhǎng)的影響，我們分別繪制了O157∶H7野生菌株、nleF基因敲除菌株ΔnleF以及回復(fù)菌株ΔnleF/NleF的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)三者在LB以及DMEM(10％FBS)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率無顯著差異，表明NleF對(duì)EHEC的生長(zhǎng)沒有影響。

5、>　　為了研究NleF對(duì)EHEC的黏附能力的影響，我們分別用O157∶H7野生菌株、nleF基因敲除菌株ΔnleF以及回復(fù)菌株ΔnleF/NleF感染HeLa細(xì)胞，利用免疫熒光分析三者對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附能力。結(jié)果表明，三種細(xì)菌黏附HeLa細(xì)胞的數(shù)目無明顯差異，說明NleF對(duì)EHEC的黏附?jīng)]有影響。
　　為了進(jìn)一步探討NleF對(duì)EHEC感染所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，我們分別用野生菌株、nleF敲除菌株及回復(fù)菌株感染HeLa細(xì)胞，于感

6、染后1.5h和5h收集細(xì)胞上清，測(cè)定LDH的釋放量，計(jì)算細(xì)胞死亡率。結(jié)果表明，與野生菌株相比，nleF敲除菌株感染后導(dǎo)致HeLa細(xì)胞死亡率明顯上升，而回復(fù)菌株感染后無明顯變化，說明NleF可能抑制EHEC感染所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，以便于細(xì)菌逃避宿主的免疫系統(tǒng)。
　　文獻(xiàn)報(bào)道Caspase-4在細(xì)菌感染所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中具有重要作用，因此我們構(gòu)建了pGEX-2TK-NleF原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)GST-NleF融合蛋白的表達(dá)，通

7、過GST pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NleF與Caspase-4存在相互作用。此外，還構(gòu)建了Caspase-4的p19亞基與p10亞基的真核表達(dá)載體。
　　本研究構(gòu)建了nleF基因敲除菌株ΔnleF和回復(fù)突變菌株ΔnleF/NleF菌株，分析了NleF對(duì)EHEC生長(zhǎng)和黏附能力的影響，探討了NleF對(duì)EHEC感染所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，并且發(fā)現(xiàn)NleF與Caspase-4存在相互作用，為進(jìn)一步研究NleF對(duì)EHEC致病性的影響奠定了