腸出血性大腸桿菌O157：H7植物疫苗的研究.pdf

1、本文針對大腸桿菌O157：H7主要免疫原EspA進行了口服植物疫苗研究。由于E.coli O157：H7的主要侵入途徑是消化道，因此在疫苗的研究中如何能夠激起機體有效的粘膜免疫是研究的重點。注射免疫途徑的疫苗往往不能有效誘導腸道內的特異免疫反應。如果口服疫苗抗原沒有經過特殊的處理而直接進行口服免疫時，能夠有效到達腸道并激起腸道內淋巴系統特異反應的抗原量太低，也不能有效誘導腸道內的免疫反應。在植物表達重組抗原的過程中，由于植物的細胞壁能夠

2、對在植物細胞內表達的重組目的蛋白進行“膠囊”樣包裹，因此在植物細胞壁的保護下，表達的抗原能夠順利進入腸道，并在消化系統對植物細胞進行腸道內消化時，釋放出目的抗原，從而激發(fā)有效的粘膜免疫。生菜作為種植廣泛，生長期短，成本低廉的常見蔬菜，具有可以生食的特點，因此在采用轉基因生菜免疫時，避免了采用煙草、土豆、水稻等植物表達的重組蛋白在口服免疫時需要對植物疫苗進行預處理的缺點，生菜轉基因疫苗能夠將在植物細胞內表達的蛋白順利地運送到腸道，刺激腸道

3、淋巴系統的反應，因此生菜口服植物疫苗的研制在臨床使用中具有可行性好，免疫成本低，免疫途徑簡單，免疫效果可靠的特點，便于疫苗的推廣。
　　 本研究通過對生菜中表達的來源于E.coli O157：H7的EspA生物學特性的研究，證實了大腸桿菌的EspA可以作為植物疫苗研究中的免疫原。本研究首次在植物細胞內進行了E.coli O157：H7表面蛋白EspA的瞬時表達及穩(wěn)定表達研究，并分別對以兩種體系中表達的重組蛋白進行了動物實驗。實驗

4、通過試驗小鼠的多克隆EspA抗體的體內及體外保護性試驗，證實了免疫試驗小鼠產生的多克隆EspA抗體的對HeLa細胞的保護性作用，并通過E.coli O157：H7(△)stx-B突變株的小鼠攻毒后的腸道病理研究發(fā)現EspA免疫后的小鼠具有對E.coli O157：H7(△)stx-B的抵抗力。
　　 第一部分：
　　 致病性大腸桿菌基因組中移動的基因元件決定了致病性的細菌的毒力，他們在病原菌侵入動物或植物后發(fā)揮毒性的過程

5、中起著關鍵的作用。其中毒力島PAI基因簇上20多個基因編碼蛋白的功能集合體-Ⅲ型分泌系統，在細菌的致病過程中發(fā)揮重要的作用。在T3SS系統中，很多與毒力相關的亞單位的裝配機制與細菌鞭毛的裝配機制類似，其致病蛋白的裝配過程均發(fā)生在細胞的外殼上。大腸桿菌黏附過程中分泌的蛋白如EspA，EspB， EspD和EspF等蛋白都是T3SS的功能蛋白。EspB及EspD蛋白位于EspA微絲的末端，這些蛋白與宿主的細胞膜相互作用，在宿主的細胞膜上形成

6、小孔后，效應因子如Tir，EspB，EspG，EspF和Map通過形成的孔道進入宿主的細胞。本試驗首次在生菜中采用瞬時表達體系表達了E.coli O157：H7的EspA蛋白。
　　 將構建好的pBI121-espA，pBI121-ΩespA載體通過液氮凍融法分別導入農桿菌AGL1，EHA105，LBA4404，GV3101和C58C1后，將帶有重組質粒的農桿菌在卡那抗性和利福平抗性的YEB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，采用真空法轉染培養(yǎng)1

7、4天的無菌生菜小苗，轉染生菜在22℃培養(yǎng)3天后，檢測各菌株轉染生菜后EspA的表達水平，試驗發(fā)現農桿菌AGL1轉染的生菜中EspA的表達量最高，農桿菌LBA4404轉染的生菜的EspA的量最低，通過檢測pBI121-espA和pBI121-ΩespA轉化農桿菌GV3101后通過真空法轉染生菜，發(fā)現pBI121-ΩespA組具有比較高的EspA表達量，通過對瞬時體系中重組蛋白的表達研究，確定了不同農桿菌菌株在生菜瞬時表達系統中的不同的轉染

8、能力，這是首次在生菜瞬時表達的系統中進行此類綜合研究。通過免疫小鼠的實驗證實生菜細胞內瞬時表達的EspA能夠刺激小鼠產生高水平的IgG和IgA抗體，這是首次關于植物表達E.coli O157：H7的主要免疫原EspA的疫苗報道。
　　 第二部分：
　　 在對致病性大腸桿菌的研究中，通常根據大腸桿菌對HeLa的黏附特性，來區(qū)分大腸桿菌EPEC和EHEC。Fluorescence actin assay試驗(FAS)是鑒定E

9、.coliO157的主要方法，同時HeLa細胞也成為E.coli O157進行細胞毒性試驗的常用模式細胞。
　　 在本部分中，乳酸菌免疫小鼠產生的多克隆抗體及生菜瞬時表達系統表達的重組蛋白免疫小鼠產生的抗體分別用來進行HeLa細胞的黏附試驗、體外抗體與E.coli O157：H7(△)stx-B結合試驗和抗體抑制菌落的生長試驗。通過這3個實驗證實EspA特異的抗體能夠阻斷E.coli O157：H7(△)stx-B向細胞內毒性蛋

10、白的轉移，并能夠抑制E.coli O157：H7(△)stx-B感染細胞產生的特異性的細胞骨架改變，但在體外的實驗中，抗體與細胞相互作用后，再用E.coli O157：H7(△)stx-B感染細胞，并不能阻止細菌與細胞的黏附。試驗的多克隆抗體能夠結合E.coliO157：H7(△)stx-B表面的EspA微絲，采用特異性的熒光標己的羊抗鼠二抗能夠在熒光鏡下觀測到特異性的熒光。在以前的報道中，原核表達的EspA免疫小鼠產生的多克隆抗體能夠

11、通過上述3個實驗得出EspA抗體具有對細胞的保護性作用。本試驗首次對乳酸菌和生菜異源表達的EspA免疫小鼠產生多克隆抗體進行類似的實驗，證實了乳酸菌和生菜表達的EspA具有與E.coli O157：H7的EspA微絲相同的抗原決定簇，并能夠應用于E.coli O157：H7的口服疫苗研究。
　　 第三部分：
　　 細胞培養(yǎng)又嚴格地分為細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)，三者是密不可分相互聯系的。組織細胞的研究已廣泛應用于生物學

12、、醫(yī)學的各個研究領域。運用組織培養(yǎng)細胞具有條件可控，誤差小，能進行單因素分析的優(yōu)點。由于培養(yǎng)條件可以人為控制，所以便于進行各種物理、化學和生物的外界因素來研究細胞生命活動規(guī)律。
　　 在本部分中，對生菜的組織培養(yǎng)進行了探討，建立了生菜的穩(wěn)定表達培養(yǎng)體系，在生菜的愈傷組織的培養(yǎng)過程中，發(fā)現0.2 mg-0.8 mg的6-BA均能誘導生菜生成愈傷組織，而在6-BA0.8 mg/l，NAA0.12 mg/l；6-BA0.3 mg/l，

13、NAA0.12 mg/l兩種激素水平存在的條件下，愈傷組織的分化出現部分的褐化。在同樣培養(yǎng)條件下，0.2，0.4 mg/l6-BA的激素水平培養(yǎng)下生菜的愈傷組織生長良好，說明0.3 mg/l6-BA的培養(yǎng)條件下，生菜細胞出現的褐化現象不是由6-BA的濃度引起的，而在6-BA0.8 mg/l，NAA0.12 mg/l；6-BA0.3 mg/l，NAA0.12 mg/l中NAA的濃度均大于其余的兩組。最終通過試驗研究發(fā)現，0.5 mg/l6

14、-BA和0.08 mg/l NAA的MS培養(yǎng)基是生菜顆粒狀愈傷組織和不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。25 d時觀察統計在含有濃度為0.3 mg/l的NAA生根培養(yǎng)基上，不僅生根率為100％，平均每株生根數為3-4條，而且生根試管苗株高為5-6 cm，生長旺盛。經抗生素培養(yǎng)基篩選后生成的愈傷組織的百分比發(fā)現各農桿菌轉染的水平分別為45.6％(AGL1)，26.6％(C58C1)，22.7％(EHA105)，25％(GV3101)，17.7％(

15、LBA4404)。轉染成功率高的農桿菌菌株依次為AGL1＞C58C1＞GV3101＞EHA105＞LBA4404。
　　 通過同樣的方法建立了EspA在生菜愈傷組織中的穩(wěn)定表達。通過連續(xù)傳代3次后，用PCR、ELISA和Western-blot對生菜愈傷組織中的基因和蛋白分別進行檢測，在生菜愈傷組織提取的基因組中檢測到espA基因，并通過ELISA檢測后發(fā)現生菜愈傷組織中表達的EspA蛋白的量為1.6μg/ml，將表達EspA蛋

16、白的生菜愈傷組織飼喂小鼠免疫后產生了高水平的抗體水平，用E.coli O157：H7(△)stx-B突變株進行動物攻毒試驗發(fā)現生菜表達的EspA愈傷組織免疫的小鼠的死亡率為50％，而對照組的死亡率為75％。通過對試驗小鼠腸道組織的病理切片檢測發(fā)現，生菜免疫組的小鼠腸道微絨毛完整，腸道基底細胞排列緊密，而空白對照組，腸道內容物增多，腸道微絨毛脫落，腸道基底細胞排列疏松，錯亂不齊。該實驗首次從病理組織學的研究方向論證了EspA植物疫苗對試驗

17、動物模型的保護作用。
　　 第四部分：
　　 EHEC O157主要產生兩種毒素，分別稱為志賀毒素樣Ⅰ(Stx1)和志賀毒素樣Ⅱ(Stx2)。在細菌體內，Stx2為分泌型表達，Stx1為胞內表達。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有細胞內毒性，能與28S rRNA作用導致蛋白質合成停止，是大腸桿菌O157H7引起臨床表現的病理基礎；B亞單位具有細胞結合特性，能與具有特定受體(Gb3)的細胞結合，從而引

18、導A亞單位發(fā)揮作用。
　　 針對B亞單位在EHEC疾病發(fā)展過程中的重要作用，在本部分中采用分子生物學方法對stx1B進行了基因克隆、原核表達和初步純化，同時在本試驗中將B亞單位與espA基因進行融合表達，期望兩種蛋白能夠在生菜細胞中同時表達，建立多抗原疫苗。但在隨后的動物試驗中雖然檢測到特異的EspA特異的IgA抗體，但并沒有檢測到特異的IgG抗體，分析其原因可能是B亞單位與espA基因之間沒有加入連接片段，而直接采用酶切位點直