腸出血性大腸桿菌O157：H7 TccP蛋白表達、純化及多克隆抗體的制備和應用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7是一種重要的傳染性病原菌。自1975年首次被分離以來，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157：H7感染可致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等疾病，嚴重者可導致死亡。EHEC O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。目前對其感染仍缺乏有效的防治方

2、法，研究證明抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)從而使患者并發(fā)HUS的危險性增加，因此進一步研究其致病機制以尋找新的有效的防治方法具有重要義。 病原體和宿主的相互作用是決定感染及發(fā)病的關(guān)鍵。EHEC與宿主腸道粘膜上皮細胞的粘附是疾病發(fā)展的第一步。介導O157細菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)。該菌通過TTSS將其轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體(Tir)和Tir-細胞骨架偶聯(lián)蛋白(TccP)等效應毒力分子轉(zhuǎn)運至

3、宿主細胞，經(jīng)一系列的信號傳導過程介導與宿主細胞的“粘附與擦拭”(A/E)損傷。TccP是最近發(fā)現(xiàn)并確定的一種新的O157：H7毒力因子，是O157轉(zhuǎn)移至宿主細胞的效應分子中與宿主細胞分子N-WiskottAldrich綜合癥蛋白(N-WASP)相互作用的終端效應分子，由O157：H7基因組內(nèi)編號為Z3072的開放閱讀框序列編碼，是一個富含脯氨酸的蛋白，為O157粘附宿主細胞、形成肌動蛋白踏板、造成A/E損傷所必需。本課題采用基因工程的方

4、法對腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7 TccP蛋白進行了克隆表達、純化，進而在此基礎(chǔ)上制備了高滴度和高特異性的兔抗TccP多克隆抗體并對其應用進行了實驗研究。首先選擇EHEC O157：H7 Sakai菌株基因組為模板，采用PCR及序列測定等方法獲得EHEC O157：H7 tccP DNA，克隆至原核表達載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達；對在C末端融合了6his純化標簽的表達產(chǎn)物進行

5、Westem blotting法分析；使用Ni<'2+>-NTA離子換樹脂進行蛋白純化；純化蛋白進行SDS-PAGE純度分析。實驗結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-tccP；Westem blotting結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌中表達了分子量為37kD左右的目的蛋白；表達產(chǎn)物經(jīng)Ni<'2+>-NTA離子交換樹脂純化，TccP-6his融合蛋白純度為95％以上。 以純化TccP-6his融合蛋白免疫新

6、西蘭大白兔，成功制備了有較高滴度和特異性的兔抗TccP多克隆抗體。以所獲特異性多克隆抗體作為一抗，使用雙向免疫擴散、ELISA、Western blotting和免疫熒光等方法檢測標本中TccP蛋白。結(jié)果顯示：免疫擴散檢測可見兔抗TccP多克隆抗體稀釋度為1∶32時，仍呈現(xiàn)明顯沉淀線；ELISA檢測結(jié)果抗體滴度為1∶640 000；Western blotting檢測表明：用兔抗TccP多克隆抗體與TccP抗原進行免疫印跡，在分子量約3

7、7kD處有一特異性條帶，與陽性對照純化TccP-6his融合蛋白相一致；細胞免疫熒光檢測顯示，在被O157細菌粘附的HeLa細胞部位可見綠色熒光，其分布與細菌粘附的部位一致。提示：所制備的兔抗TccP多克隆抗體與粘附至HeLa細胞的O157細菌發(fā)生抗原抗體反應，重組的TccP表現(xiàn)有與天然細菌分泌的TccP相同的免疫原性。 在本課題實驗研究中，從EHEC O157:H7 Sakai菌株的基因組中克隆得到了O157 tecPDNA序

8、列，該序列與GenBank報道的序列完全一致；所構(gòu)建的TccP原核表達載體在大腸桿菌中獲得了高效表達，經(jīng)純化后得到了高純度TccP-6his融合蛋白。以傳統(tǒng)的多克隆抗體技術(shù)制備了兔抗TccP多克隆抗體。該多克隆抗體可用于對EHECO157：H7中TccP蛋白進行特異性檢測，適用于雙向免疫擴散、ELISA、Westem blotting和免疫熒光等多種常規(guī)檢測方法。利用掃描電鏡觀察了O157體外粘附細胞模型，結(jié)果顯示O157與HeLa細胞

9、緊密粘附，呈典型的局灶性粘附(LA)。使用兔抗TccP多克隆抗體對EHECO157：H7粘附宿主細胞模型內(nèi)的TccP蛋白進行了亞細胞定位研究，結(jié)果直觀地顯示了TccP被聚集在宿主細胞被EHEC O157：H7粘附處細胞膜的下方。tccP基因的克隆表達、純化，TccP蛋白的獲得以及特異性兔抗TccP多克隆抗體的制備及應用成功，為后續(xù)進一步研究TccP在O157致病機制中的作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)未見類似研究報道，故本研究具有一定的創(chuàng)