抗腸出血性大腸桿菌O157：H7志賀樣毒素Ⅱ基因工程抗體的實驗研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157∶H7是一種重要的新發(fā)人畜共患傳染病病原菌。自1975年被首次分離、1982年被確認為致病菌以來的近30年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHECO157∶H7感染可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagiccolitis，HC)，還可在5～10％的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合癥(hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thromboticthro

2、mbocytopenicpurpura，TTP)等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導(dǎo)致死亡。EHECO157∶H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。我國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。同時，O157∶H7菌培養(yǎng)容易、繁殖迅速、感染力強、感染途徑廣泛，使之極有可能作為未來軍事斗爭中的細菌戰(zhàn)劑和生物恐怖戰(zhàn)劑。美國疾病預(yù)防控

3、制中心(CDC)已將EHECO157∶H7菌列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。 目前，EHECO157∶H7的全基因組測序已經(jīng)完成，但對其感染仍缺乏有效的治療方法。臨床上針對O157∶H7菌的感染主要采用抗生素治療及相應(yīng)的對癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素使菌體破裂，導(dǎo)致O157∶H7菌志賀樣毒素(Shigaliketoxin，Stx)的釋放水平大大提高，使得抗生素對病程無明顯影響甚至導(dǎo)致病程的延長，從而增加發(fā)生并發(fā)癥的危險并引起死

4、亡。人類同感染性疾病作斗爭的歷史證明，抗體是治療某些感染性疾病的首選方法。由于O157∶H7菌的感染易引起暴發(fā)流行，且對其感染尚缺乏有效的治療方法，治療性抗體的研究就顯得尤為緊迫。 EHECO157∶H7主要產(chǎn)生兩種毒素，分別稱為志賀樣毒素Ⅰ(Stx1)和志賀樣毒素Ⅱ(Stx2)。在細菌體內(nèi)，Stx2為分泌型表達，Stx1為胞內(nèi)表達。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有細胞內(nèi)毒性，能與28SrRNA作用從而抑

5、制蛋白質(zhì)合成，是大腸桿菌O157∶H7引起臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)；B亞單位具有細胞結(jié)合特性，能與具有特定糖鞘脂受體(Gb3)的細胞結(jié)合，從而引導(dǎo)A亞單位發(fā)揮作用，是志賀樣毒素致病的關(guān)鍵。多數(shù)O157∶H7細菌產(chǎn)生Stx2，而且Stx2毒性強于Stx1，與HUS及TTP等嚴重并發(fā)癥的相關(guān)性更為密切。因此Stx2是該菌致病性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是理想的制備中和毒素的特異性抗體的靶抗原。 EHECO157∶H7感染致病的機理主要包括兩個方面，

6、即在腸道的定植以及產(chǎn)生毒素Stx，Stx可以進入血液循環(huán)，引起靶組織器官，如腎小球和結(jié)腸內(nèi)皮細胞的損傷。Stx與其糖鞘脂受體Gb3的特異性結(jié)合決定了該毒素的致病性，因此特異性阻止Stx和Gb3受體結(jié)合的能中和Stx的抗體可以防止進一步引起病理變化。 基于以上認識，本研究從以下幾個方面進行治療性抗腸出血性大腸桿菌O157∶H7志賀樣毒素Ⅱ基因工程抗體的實驗研究。 1.O157∶H7全毒素及其亞單位抗原的獲得 方法；

7、按Genbank公布的Stx2核酸序列，根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計了三對引物，以Stx2cDNA為模板，選擇合適的PCR反應(yīng)條件進行擴增。T-A克隆后構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達。經(jīng)鎳離子親和層析聯(lián)合分子篩純化目的蛋白Stx2A及Stx2B，并經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot、免疫家兔等鑒定重組蛋白的純度和免疫學(xué)活性。通過對HeLa細胞的細胞毒作用及對Balb/c小鼠攻毒實驗，鑒

8、定重組蛋白Stx2的生物學(xué)活性。結(jié)果PCR法自O(shè)157∶H7菌基因組分別擴增得到stx2(約1240bp)、stx2a(約890bp)及stx2b(約210bp)的基因片段，片段大小與預(yù)期相符。原核表達質(zhì)粒pET11c-stx2、pET11c-stx2a、pET22b(+)-stx2b經(jīng)酶切及測序鑒定與GenBank公布的序列完全一致。轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Stx2、Stx2A及Stx2B蛋白的表達率分別

9、為25％、30％、30％。破菌后SDS-PAGE證實，Stx2A蛋白以包涵體形式表達，Stx2B蛋白以可溶形式表達。純化后的Stx2A及Stx2B蛋白，純度＞85％。Stx2A及Stx2B免疫家兔獲得了較高效價的多抗血清，雙擴效價分別為1∶16和1∶8。重組蛋白Stx2主要以包涵體形式表達，亦有可溶形式表達。可溶形式表達的Stx2具有與Gb3結(jié)合活性，CD50約為35pg，對小鼠的LD100為0.010mg；O157∶H7菌超聲破菌上清

10、中的Stx2毒素對HeLa細胞的CD50約為50pg，對小鼠的LD100約為0.050mg，結(jié)果表明，在總蛋白濃度相同的條件下，重組工程菌pET11c-stx2/BL21超聲破菌上清中的Stx2毒素含量高于野生型O157∶H7菌株的Stx2含量，差異極顯著，p＜0.01。結(jié)論重組蛋白Stx2A及Stx2B具有免疫學(xué)活性，可以替代野生型O157∶H7分泌的天然毒素Stx2蛋白，以用作抗原制備抗Stx2的新型的基因工程抗體?？扇苄问奖磉_的重

11、組蛋白Stx2具有生物學(xué)活性，可用于O157∶H7感染的基礎(chǔ)與臨床研究。 2.鼠抗Stx2亞單位單克隆抗體的制備及生物學(xué)功能研究 方法；單克隆抗體的制備參照傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)方法進行，將小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與Stx2A(Stx2B-BSA)免疫的Balb/c小鼠的脾臟B淋巴細胞在聚乙二醇(PEG)作用下進行細胞融合，ELISA法篩選出穩(wěn)定分泌抗Stx2A(Stx2B)單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔誘生

12、腹水以獲得大量單克隆抗體。采用親和層析法(蛋白A-Sepharose)純化腹水IgG，并對其類和亞類及輕鏈型進行鑒定。SDS-PAGE鑒定IgG純度，ELISA法檢測腹水效價，間接ELISA法測定抗體的親和常數(shù)，Westernblot鑒定單克隆抗體特異性及其作用抗原的分子量，通過非標記ELISA相加試驗分析單抗所識別的抗原表位。通過檢測抗體體外抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用和在小鼠體內(nèi)中和毒素的實驗鑒定抗體的生物學(xué)功能。結(jié)果獲得

13、2株能穩(wěn)定分泌抗Stx2A抗體的單克隆雜交瘤細胞株，5F3和5C11；2株能穩(wěn)定分泌抗Stx2B抗體的單克隆雜交瘤細胞株1A4和1A5。將4株細胞分別注入小鼠腹腔，均成功誘生大量腹水。腹水IgG抗體經(jīng)親和層析法純化后純度均達85％以上。雜交瘤單克隆細胞株5F3、5C11、1A4和1A5分泌的單克隆抗體分別屬于IgG1、IgG2a、IgG1和IgG1，輕鏈均為κ型；親和常數(shù)Ka分別為1.7×109、6.3×108、5.7×107和1.9×

14、107。Westernblot結(jié)果表明，單抗5F3、5C11、1A4和1A5均能與野生型O157∶H7超聲破菌上清中的天然Stx2毒素蛋白特異結(jié)合。4株單抗在體外均能中和野生型O157∶H7菌超聲上清中的Stx2毒素，從而抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用，與無關(guān)抗體1D6比較，差異極顯著，p＜0.01；同等劑量的抗體，抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用的抑制率不同， 5F3＞5C11＞1A4＞1A5，差異極顯著，p＜0

15、.01；50％抑制率時4株單抗的劑量約為0.1～0.25μg。在動物體內(nèi)，4株單抗均具有一定的中和活性，對Stx2毒素致死小鼠產(chǎn)生免疫性保護，與1D6對照組比較，小鼠的存活率差異極顯著，p＜0.01；同等劑量的抗體，對Stx2毒素致死小鼠的免疫保護作用不同，5F3＞5C11＞1A4＞1A5，小鼠的存活率差異極顯著，p＜0.01；0.15mg的抗Stx2A抗體5F3在小鼠體內(nèi)能中和致死劑量的毒素，對Stx2毒素致死小鼠的免疫保護達80％。

16、 結(jié)論；4株抗Stx2單抗均具有一定的中和活性，中和活性最強的抗Stx2A單抗5F3可用于構(gòu)建抗Stx2A單鏈抗體。 3.抗Stx2A單鏈抗體的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析 方法；從雜交瘤細胞5F3中提取總RNA，以oligo(dT)15為隨機引物，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物分別擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因用一編碼(Gly4Ser)3短肽的DNA片段連接成5’VH-Li

17、nker-VL3’片段，PCR擴增該片段。純化后的scFv片段與經(jīng)改造的載體pCANTAB6his相連，轉(zhuǎn)化E.coliTG1。對抗體基因進行測序，采用生物信息學(xué)方法對所得序列與現(xiàn)有已報道的其它各種抗體基因進行同源性比較，并分析其胚系基因來源。對由DNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析并通過分子建模分析其二級結(jié)構(gòu)。 4.抗Stx2A單鏈抗體在體外、體內(nèi)中和Stx2的實驗研究 方法；重組子轉(zhuǎn)入E.coliHB2151，構(gòu)建重組

18、工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)上清液、重組工程菌及超聲破菌上清液與沉淀。超聲上清液和培養(yǎng)上清液經(jīng)鎳離子親和層析純化scFv。經(jīng)SDS-PAGE、Westemblot等鑒定scFv抗體的純度和特異性。通過檢測抗體體外抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用和在小鼠體內(nèi)中和毒素的活性鑒定抗體的生物學(xué)功能。 綜上所述，，本課題的實施作為本室O157∶H7感染治療性抗體研究的起步，希望能為這個意義重大的研究課題奠定一定的基礎(chǔ)。