腸出血性大腸桿菌O157-H7TccP蛋白與宿主細(xì)胞IRTKS蛋白的相互作用研究.pdf

1、背景：
　　 腸出血性大腸桿菌(enterohaemorragic Escherichia coli，EHEC) O157:H7為重要的人畜共患傳染病原，其感染具有暴發(fā)流行、強(qiáng)烈的致病性與致死性和抗生素治療加劇病情等特點，同時它還可作為細(xì)菌武器與生物恐怖戰(zhàn)劑的原料，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。加強(qiáng)其致病機(jī)理的研究對提高由該菌引起的流行病、生物恐怖的預(yù)防和處理能力，具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 病原體和宿主的相互作用是決

2、定感染的關(guān)鍵。EHEC O157:H7 主要通過緊密粘附素intimin與其在上皮細(xì)胞膜表面的受體Tir(translocated intimin receptor)結(jié)合，粘附和定植于宿主細(xì)胞表面，引起特異性粘附擦拭損傷(attaching and effacing lesions, A/Elesions)，同時分泌強(qiáng)烈致死性毒素志賀毒素(shiga toxin)，最終引起宿主發(fā)生腹瀉、出血性腸炎及溶血性尿毒綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥。A/E

3、損傷形成是一系列效應(yīng)分子參與的信號傳導(dǎo)過程，涉及包括細(xì)菌和宿主細(xì)胞的多種效應(yīng)分子間的相互作用。TccP(TirCouple Cytoskeleton Protein，內(nèi)膜素受體偶聯(lián)細(xì)胞骨架蛋白)是近年研究新發(fā)現(xiàn)的EHEC O157:H7 致病分子，它經(jīng)EHEC O157:H7的Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮致病作用。TccP 含有富含脯氨酸的重復(fù)片段，該重復(fù)片段為與宿主細(xì)胞IRTKS效應(yīng)蛋白SH3 結(jié)構(gòu)域相互作用的功能單元。EHEC

4、 O157菌株之間TccP的重復(fù)片段存在差異，這種差別可能與A/E 損傷的形成和致病性有關(guān)。
　　 前期課題組分離鑒定了一株弱毒的EHEC O157:H7，其具有3個脯氨酸富集重復(fù)片段TccP，介導(dǎo)A/E 損傷能力下降[1]。為進(jìn)一步闡明其致病的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究擬在體外直接觀察TccP的3個脯氨酸富集重復(fù)片段TccP(3R)和IRTKS蛋白SH3 結(jié)構(gòu)域的相互作用。
　　 目的：
　　 1.采用DNA 重組技術(shù)分

5、別克隆表達(dá)TccP蛋白的3個脯氨酸富集重復(fù)片段(TccP(3R))和IRTKS蛋白SH3 結(jié)構(gòu)域(SH3(IRTKS))。
　　 2.利用Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印記以及凝膠過濾層析和晶體培養(yǎng)分析TccP(3R)與SH3(IRTKS)在體外的相互作用。
　　 方法：
　　 1.重組表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增TccP(3R)和SH3(IRTKS)基因片段，分別連接于原核

6、表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)和pET30a(+)獲得重組質(zhì)粒。酶切、測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組工程菌。
　　 2.重組蛋白的表達(dá)和純化重組工程菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，超聲破菌，Tricine-SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)形式。TccP(3R)蛋白依次經(jīng)過Ni-NTA 親和層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析；
　　 SH3(IRTKS)蛋白依次經(jīng)過Ni-NTA 親和層析和凝膠過濾層析

7、，進(jìn)行蛋白純化。純化后TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白經(jīng)蛋白超濾離心管濃縮，BCA 法測定蛋白濃度。
　　 3.TccP(3R)與SH3(IRTKS)體外結(jié)合實驗根據(jù)TccP(3R)和SH3(IRTKS)的氨基酸序列，通過DNAStar 軟件預(yù)測分子量。根據(jù)分子量和已測定的質(zhì)量濃度，換算摩爾濃度。將TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白按照摩爾比1:10混合進(jìn)行體外結(jié)合實驗。
　　 4.體外結(jié)合實驗結(jié)果的分

8、析通過Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印記對體外結(jié)合實驗得到的混合物進(jìn)行分析。
　　 利用凝膠過濾層析對體外結(jié)合實驗得到的混合物進(jìn)行分析。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、TccP(3R)、SH3(IRTKS)以及體外結(jié)合實驗得到的混合物分別通過凝膠過濾層析Superdex75 10/300柱，獲得出峰體積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白出峰體積和其已知的分子量求得Kav和LogMw值，利用Kav和LogMw值算出回歸直線方程式，將Tc

9、cP(3R)、SH3(IRTKS)及其混合物中蛋白的出峰體積代入方程式，算出各蛋白的分子量。求TccP(3R)與SH3(IRTKS)的分子量之和，通過與TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體分子量的比較，估算TccP(3R)與SH3(IRTKS)相互結(jié)合的比例。
　　 5. TccP(3R)-SH3(IRTKS)復(fù)合體的晶體學(xué)研究將體外結(jié)合實驗得到的混合物進(jìn)行凝膠過濾層析，以獲得純化的TccP(3R)-SH3(IRTK

10、S)蛋白復(fù)合體。應(yīng)用Hampton Research 公司的晶體初篩試劑盒進(jìn)行蛋白復(fù)合體結(jié)晶條件的初步篩選。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶切、DNA 測序鑒定結(jié)果證實成功構(gòu)建了pET28a(+)-TccP(3R)和pET30a(+)-SH3(IRTKS)重組表達(dá)載體。
　　 2.重組工程菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破菌并離心，上清和沉淀經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果表明：TccP(3R)、SH3(I

11、RTKS)均主要存在于上清中，目的蛋白經(jīng)純化后純度大于98％。
　　 3.將純化的TccP(3R)和SH3(IRTKS)體外混合，Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：
　　 出現(xiàn)兩條分子量大小分別與TccP(3R)和SH3(IRTKS)相符的條帶；非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果表明：原TccP(3R)條帶消失，出現(xiàn)一條新的蛋白帶；以兔抗TccP抗體為一抗進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示：新條帶能夠與抗TccP抗體反

12、應(yīng)而顯色。
　　 4.根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠過濾層析出峰體積和分子量，通過回歸分析得到直線方程式：Kav=1.476608-0.27976*LogMw (R2=0.926).
　　 5. TccP(3R)、SH3(IRTKS)及兩者復(fù)合體的凝膠過濾層析出峰體積分別為12.0ml、14.5ml和11.4ml，根據(jù)出峰體積求得分子量分別為24238、6698和33002。根據(jù)TccP(3R)、SH3(IRTKS)及兩者復(fù)合體分

13、子量的關(guān)系，估算TccP(3R)與SH3(IRTKS)的結(jié)合比例約為1:1。
　　 5.通過凝膠過濾層析獲得了TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白復(fù)合體。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用基因工程技術(shù)高效表達(dá)了可溶性TccP(3R)、SH3(IRTKS)重組蛋白，并通過純化獲得了高純度的目的蛋白。
　　 2.TccP(3R)與SH3(IRTKS)蛋白在體外能發(fā)生相互作用，并形成蛋白復(fù)合體。