大腸桿菌O157-H7在土壤組分上的界面作用和存活.pdf

1、全球每年約產(chǎn)生1010t-1011t畜禽糞便，而畜禽糞便中含有大量的病原微生物。若未經(jīng)有效處理，就直接作為糞肥或土壤改良劑施入到農(nóng)田，會(huì)導(dǎo)致土壤生物污染，進(jìn)而引發(fā)人畜共患病的傳播、感染及暴發(fā)。腸出血性大腸桿菌O157∶H7是常見(jiàn)的人畜共患病原菌，因其感染劑量低（10個(gè)活細(xì)胞），并發(fā)癥嚴(yán)重（溶血性尿毒癥），而備受關(guān)注。該病原菌主要通過(guò)畜禽糞便進(jìn)入土壤環(huán)境，可在土壤中存活1年以上，易感染環(huán)境中的動(dòng)物;而感染的動(dòng)物又會(huì)重新產(chǎn)生并釋放病原菌，周

2、而復(fù)始，導(dǎo)致惡性循環(huán)。此外，土壤中的大腸桿菌O157∶H7可發(fā)生遷移，不僅會(huì)污染地表水和地下水，也會(huì)污染土壤中種植的蔬菜瓜果等農(nóng)產(chǎn)品，嚴(yán)重威脅人類健康和公共安全。近30年來(lái)，全球共暴發(fā)上百次大腸桿菌O157∶H7感染性腹瀉事件。其中，免疫功能不全的兒童或老人備受威脅，感染病原菌后的死亡率可高達(dá)15％。因此，本文以大腸桿菌O157∶H7和多種土壤組分（不同類型土壤、不同粒徑土壤顆粒、粘土礦物）為材料，采用土壤化學(xué)和分子生物學(xué)方法，如土壤基

3、本性質(zhì)的表征，等溫平衡粘附，細(xì)胞平板計(jì)數(shù)，結(jié)晶紫染色法，定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)法等;借助掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、熒光顯微鏡等現(xiàn)代分析儀器，探究大腸桿菌O157∶H7與土壤組分的界面互作和存活機(jī)制，以阻控由病原菌引起的土壤生物污染。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)闡明了土壤理化性質(zhì)和大腸桿菌O157∶H7粘附行為的相關(guān)性及貢獻(xiàn)程度。一元線性回歸分析表明，大腸桿菌O157∶H7的平衡分配系數(shù)（Kd）與土壤有機(jī)質(zhì)的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(

4、P＜0.01)，而土壤pH、電導(dǎo)率、粘粒含量、比表面積、陽(yáng)離子交換量(CEC)和Kd無(wú)顯著相關(guān)(P＞0.05)。偏相關(guān)分析排除其它因素的干擾，發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)和粘粒共同控制大腸桿菌O157∶H7的粘附行為(P＜0.05)。通過(guò)多元逐步回歸手段，得到Kd和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性方程:Kd=-1.306×OM+0.536×CC+51.036(P＜0.01)，表明有機(jī)質(zhì)是最重要的影響因素，對(duì)病原菌粘附的貢獻(xiàn)率為66.95％，顯著高于粘粒(33.0

5、5％)。因此，土壤有機(jī)質(zhì)和粘粒等固相性質(zhì)調(diào)控大腸桿菌O157∶H7的粘附行為，最終影響病原菌在環(huán)境中的遷移和分布。
　　(2)探明了土壤類型（紅壤/棕壤），顆粒大?。ㄉ傲！⒎哿：驼沉＃?，氧（氫氧）化鐵/鋁，有機(jī)質(zhì)對(duì)大腸桿菌O157∶H7在土壤環(huán)境中存活的影響機(jī)制。大腸桿菌O157∶H7接種于棕壤顆粒中，3d內(nèi)，病原菌的數(shù)量上升0.6 log10CFU/g-1.4 log10 CFU/g（除去有機(jī)質(zhì)粘粒外）。而紅壤顆粒中的大腸桿菌O

6、157∶H7數(shù)量快速下降，直到檢測(cè)下線;初始6h的失活速率最高，病原菌的數(shù)量下降0.52log10 CFU/g-0.97 log10 CFU/g。去除氧（氫氧）化鐵/鋁后，紅壤顆粒的殺菌性能降低，大腸桿菌O157∶H7的存活能力顯著提高。對(duì)兩種土壤而言，大腸桿菌O157∶H7均在含有機(jī)質(zhì)粘粒中的存活能力最強(qiáng)。相比于砂粒和粉粒，粘粒對(duì)大腸桿菌O157∶H7的吸附能力更強(qiáng)，對(duì)病原菌的乙酸代謝途徑相關(guān)基因的影響更顯著(pta上調(diào)6.1倍-9.

7、3倍，ackA下調(diào)63.5％-91.7％)。pta上調(diào)和ackA下調(diào)會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)乙酰磷酸的累積，加速細(xì)菌從游離態(tài)向生物被膜形態(tài)的轉(zhuǎn)變。此外，粘粒更有助于大腸桿菌O157∶H7保持生理活性。8d后，粘粒中病原菌的腺苷-5'-三磷酸(ATP)的含量(0.36×10-18 mol ATP/CFU-0.39×10-18 mol ATP/CFU)顯著高于砂粒和粉粒中的病原菌ATP含量(0.13×10-18 mol ATP/CFU-0.21×10-1

8、8 molATP/CFU)。砂粒和粉粒去除有機(jī)質(zhì)后，大腸桿菌O157∶H7的生理活性未發(fā)生明顯改變，且病原菌的存活時(shí)間顯著提高，表明有機(jī)質(zhì)的作用不是提供養(yǎng)分。而有機(jī)質(zhì)的去除，會(huì)提高土壤顆粒對(duì)病原菌的吸附能力。因此，我們推測(cè)難溶性有機(jī)質(zhì)的主要作用是遮蔽土壤顆粒的粘附位點(diǎn)，影響細(xì)菌-土壤顆粒的界面作用，阻礙細(xì)菌粘附表型的轉(zhuǎn)變，最終影響病原菌的存活。上述結(jié)果表明，大腸桿菌O157∶H7在土壤顆粒表面的粘附及其相關(guān)代謝途徑是存活優(yōu)勢(shì)，幫助細(xì)菌在

9、自然環(huán)境中的長(zhǎng)期存活。
　　(3)明確了典型土壤粘土礦物（蒙脫石、高嶺石和針鐵礦）對(duì)大腸桿菌O157∶H7生長(zhǎng)，生物被膜形成和毒性基因表達(dá)的影響機(jī)制。帶負(fù)電的蒙脫石促進(jìn)大腸桿菌O157∶H7的生長(zhǎng)，抑制生物被膜的形成;邊面帶正電的高嶺石有利于病原菌的粘附，促進(jìn)生物被膜的形成;帶正電的針鐵礦顯著抑制病原菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)生物被膜的形成。熒光顯微鏡照片顯示，針鐵礦能有效粘附并殺滅大腸桿菌O157∶H7，而高嶺石和蒙脫石均不影響病原菌的活性

10、。原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡顯示了大腸桿菌O157∶H7和礦物多樣的結(jié)合方式，蒙脫石疏散的分布在病原菌周圍，未發(fā)生有效粘附，高嶺石主要通過(guò)邊面和病原菌發(fā)生粘附，而針鐵礦緊密粘附在病原菌表面，形成礦物包被體。和空白對(duì)照相比(17.05±2.41nN)，蒙脫石中形成的細(xì)菌生物被膜的粘性顯著降低（10.38±1.29nN）(P＜0.05)，高嶺石略為促進(jìn)生物被膜的粘性（19.85±3.34nN），但不顯著（P＞0.05）。而針鐵礦誘導(dǎo)形成高

11、粘性的生物被膜（29.00±4.84nN），并且生物被膜中的細(xì)菌形貌發(fā)生顯著變化:細(xì)胞變小、粗糙度增加且不規(guī)則?；蚪Y(jié)果進(jìn)一步證實(shí)大腸桿菌O157∶H7生物被膜的形成機(jī)制。蒙脫石促進(jìn)病原菌中編碼鞭毛蛋白的基因-fliC的表達(dá)，增加細(xì)菌的游動(dòng)性;下調(diào)編碼菌毛蛋白的基因-csgA，阻礙細(xì)菌的不可逆粘附（生物被膜形成的初始階段）;下調(diào)莢膜異多糖(EPS重要組分)組分基因-wcaM，降低生物被膜的粘性，抑制生物被膜的形成和成熟。高嶺石體系中，病

12、原菌的fliC下調(diào)，而csgA上調(diào)，利于細(xì)菌在界面上的不可逆粘附;wcaM上調(diào)，會(huì)提高生物被膜的粘性，有利于生物被膜的形成。此外，pta上調(diào)和ackA下調(diào)，導(dǎo)致乙酰磷酸的積聚，進(jìn)一步促進(jìn)菌毛和莢膜異多糖的分泌，加速生物被膜的成熟。針鐵礦不僅促進(jìn)莢膜異多糖的調(diào)控基因(rcsA，rcsB和rcsC)和wcaM的表達(dá)，而且誘導(dǎo)病原菌群體密度感應(yīng)信號(hào)分子（Autoinducer-2）的調(diào)控基因-luxS的表達(dá)，促進(jìn)生物被膜的形成。生物被膜形成初