全反式維甲酸、亞砷酸對(duì)白血病NB4細(xì)胞CD-,44-變異體表達(dá)的影響.pdf

1、目的：急性早幼粒細(xì)胞白血病是急性髓細(xì)胞白血病的一個(gè)亞型，APL出現(xiàn)特異的染色體和基因改變，這是APL發(fā)病及應(yīng)用全反式維甲酸和亞砷酸治療有效的分子基礎(chǔ)，其療效已得到國內(nèi)外的公認(rèn)。
　　 研究采用ATRA、As2O3作用于人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)抑制狀況、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化及凋亡、并應(yīng)用RQ-PCR法檢測(cè)ATRA、As2O3作用前后NB4細(xì)胞CD44v3、CD44v6及CD44v

2、10及PML/RARα mRNA表達(dá)水平的變化。旨在探討誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化或凋亡過程中不同CD44v分子和PML/RARα表達(dá)的變化，及二者的相互關(guān)系，為CD44v作為白血病診斷、療效判斷及預(yù)后指標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　 方法：體外培養(yǎng)人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞，分別用ATRA、As2O3、ATRA+As2O3進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；用流式細(xì)胞術(shù)分析以上藥物對(duì)細(xì)胞分化的影響；AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)

3、上述藥物對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用RQ-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達(dá)水平變化。所得結(jié)果運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。
　　 結(jié)果：1.ATRA、As2O3作用下NB4細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：NB4細(xì)胞株具有急性早幼粒白血病細(xì)胞的典型形態(tài)，胞漿充滿顆粒，核膜略凹陷，有空泡。Wright’s-Giemsa染色光鏡下觀察：經(jīng)ATRA作用后NB4細(xì)胞體積變小、核漿比例縮

4、小、染色質(zhì)變粗糙、核仁消失；核形態(tài)不規(guī)則，呈腎形、桿狀及分葉核。As2O3作用于NB4細(xì)胞后表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜完整，胞漿中出現(xiàn)空泡，核染色質(zhì)濃縮、碎裂成塊彌散在胞漿中，并可見膜結(jié)構(gòu)包裹的凋亡小體。
　　 2.ATRA、As2O3對(duì)NB4細(xì)胞的增殖抑制作用：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對(duì)NB4細(xì)胞均有增殖抑制作用，隨時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率明顯增加，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較，除ATRA組24h與48h之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

5、之外，其他時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一時(shí)間點(diǎn)，各個(gè)處理組之間比較，24h各處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，48h與96h各處理組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，生長(zhǎng)抑制率As2O3+ATRA組大于As2O3組，大于ATRA組；72h As2O3+ATRA大于As2O3組和ATRA組，而As2O3組和ATRA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞表面CD11b抗原表達(dá)的影響：ATRA作用于NB4細(xì)胞

6、48h、72h、96h后，CD11b抗原表達(dá)分別為(32.47±2.95)[％]、(84.93±1.45)[％]、(90.9±0.35)[％]；As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后，CD11b抗原表達(dá)分別為(10.97±1.33)[％]、(15.7±0.87)[％]、(18.9±0.30)[％]；ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后，CD11b抗原表達(dá)分別為(18.57±0.65)[％]、(21.1

7、7±0.65)[％]、(26.53±0.83)[％]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：各個(gè)處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)，CD11b表達(dá)逐漸增多，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異；同一時(shí)間點(diǎn)，各處理組間比較，CD11b的表達(dá)ATRA組大于ATRA+As2O3組，大于As2O3組，均高于空白對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響：ATRA作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(0.57±0.

8、06)[％]、(0.90±0.20)[％]、(1.07±0.35)[％]、(1.20±0.30)[％]；As2O3作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(9.53±0.59)[％]、(13.77±0.70)[％]、(18.27±0.35)[％]、(16.23±1.15)[％]；ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(2.27±0.32)[％]、(3.93±0.25)

9、[％]、(7.83±0.40)[％]、(9.00±0.75)[％]。經(jīng)單因素方差分析，在對(duì)照組中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的早期、中晚期和總凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明自然凋亡對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究的其他統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有影響。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ATRA組與對(duì)照組早期凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，24h～72h ATRA組與對(duì)照組中晚期凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，96h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。As2O3作用24h細(xì)胞早期凋亡率較高，而在As2O3作用48h以后細(xì)胞以中晚期凋亡為主。24h、48h、7

10、2h As2O3處理的NB4細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)，早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均明顯增高，呈時(shí)間依賴性，96h較72h早期凋亡率降低，總凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)As2O3組凋亡率均高于其他各組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達(dá)水平的影響：RQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，以各組各指標(biāo)空白對(duì)照組RQ值為1，ATR

11、A作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.4867±0.0040、0.2380±0.0056、0.2137±0.0061；CD44v3的RQ值分別為：0.6437±0.0042、0.6263±0.0047、0.4020±0.0030；CD44v6的RQ值分別為：0.8370±0.0040、0.5417±0.0040、0.4263±0.0051；CD44v10的RQ值分別為：0.4940±0.0026、

12、0.3780±0.0030、0.2643±0.0067；As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.3180±0.0027、0.3030±0.0040、0.2863±0.0047；CD44v3的RQ值分別為：0.6527±0.0045、0.4957±0.0057、0.2223±0.0035；CD44v6的RQ值分別為：0.5817±0.0047、0.5343±0.0042、0.4617±0.00

13、38；CD44v10的RQ值分別為：0.5263±0.0045、0.2490±0.0036、0.3347±0.0040；ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.6983±0.0025、0.2717±0.0035、0.1910±0.0036；CD44v3的RQ值分別為：0.4543±0.0047、0.4127±0.0040、0.1980±0.0070；CD44v6的RQ值分別為：0.

14、5027±0.0040、0.3230±0.0020、0.2787±0.0020；CD44v10的RQ值分別為：0.4657±0.0035、0.4260±0.0598、0.1487±0.0035；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：除ATRA+As2O3組48h與72h之間CD44v10的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，各處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)上述各指標(biāo)的表達(dá)均呈遞減趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同一時(shí)間點(diǎn)，不同處理組之間上述各個(gè)指標(biāo)下降趨勢(shì)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：除72h經(jīng)A

15、TRA和ATRA+As2O3作用前后CD44v10的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他各組均可得出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達(dá)經(jīng)ATRA+As2O3作用后下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)繪制散點(diǎn)圖并應(yīng)用直線相關(guān)分析得出：經(jīng)ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PML/RARα與CD44v6的變化趨勢(shì)均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.98、r=0.951、r=0.9

16、99；As2O3作用前后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PML/RARα與CD44v3的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，r=0.965，其他各組之間無直線相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：1.ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對(duì)NB4細(xì)胞具有增殖抑制作用，隨時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率明顯增加；同一時(shí)間點(diǎn)，各個(gè)處理組之間比較，48h、72h和96h As2O3+ATRA組生長(zhǎng)抑制率均高于As2O3組和ATRA組。
　　 2.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可誘導(dǎo)N

17、B4細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)增加，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增加；同一時(shí)間點(diǎn)，各處理組間比較，ATRA組處理的NB4細(xì)胞CD11b的表達(dá)明顯高于ATRA+As2O3組和As2O3組。
　　 3.As2O3、ATRA+As2O3可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。隨時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，呈時(shí)間依賴性。As2O3作用24h細(xì)胞早期凋亡率較高，48h以后細(xì)胞以中晚期凋亡為主。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間As2O3處理的NB4細(xì)胞早期凋亡率、中晚期凋亡

18、率及總凋亡率均明顯高于其他各組。
　　 4.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可使NB4細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達(dá)下降，呈時(shí)間依賴性。ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達(dá)下降明顯高于其他處理組。經(jīng)ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PML/RARα與CD44