鼻咽癌相關新基因LOC344967的功能研究.pdf

1、研究背景與目的：惡性腫瘤越來越成為人類的殺手，給世界尤其是發(fā)展中國家?guī)沓林刎摀?。?jù)WHO公布，目前約有2千5百萬腫瘤患者，每年新增病例達1千萬左右，到2020年將達到3千萬患者，新增病例達每年1千6百萬，且每年將有1千萬人死于腫瘤疾病。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是來源于人類鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，其病因涉及遺傳因素、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染和化學致癌物作用，是

2、一種經(jīng)典的復雜性狀疾病。鼻咽癌在世界范圍少見，但在中國南方、東南亞和北非的部分國家非常常見。
　　 目前對導致鼻咽癌的基因研究仍未有突破性進展，一般認為鼻咽癌是遺傳因素，EB病毒和環(huán)境因素及其相互作用的結果。因此鼻咽癌是研究“基因一環(huán)境一病毒”相互作用導致癌癥病理發(fā)生的一個極具代表性的模型。1975年，SimonsMJ報道了人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)基因座和鼻咽癌的發(fā)病風險相關，許多

3、后來的研究也肯定了這一發(fā)現(xiàn)[1]。Lu SJ等開展了受累同胞對連鎖分析，他們的研究結果表明HLA區(qū)域可能存在與鼻咽癌相關的易感基因。在易感基因定位方面除了發(fā)現(xiàn)HLA位點或者其單體型與鼻咽癌有關外，湖南一個研究小組運用鼻咽癌家系標本將易感位點定位在染色體3p21上。同時，在對候選基因的關聯(lián)研究中，相關聯(lián)的多態(tài)位點還有T細胞受體TCR(T cellreceptor)基因，谷胱甘肽轉移酶GSTM I(Glutathione S-Transfe

4、rase M1)基因，細胞色素氧化酶P4502E1基因，多聚免疫球蛋白受體PIGR(Polyimmunoglobulinreceptor)基因。熱休克蛋白HSP70-2和DNA修復酶基因XRCC1(X-ray repaircross-complementing group1)，hOGG1(human8-Oxoguanine DNA Glycosylase)以及其他的一些基因也被報道和鼻咽癌的發(fā)病風險相關。這些研究結果提示可能很多基因參與

5、了鼻咽癌發(fā)生不同的信號轉導通路或細胞功能的活化，它們的協(xié)同作用導致了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，而這與腫瘤的多因素遺傳模式是吻合的。
　　 對于鼻咽癌的家族聚集性已經(jīng)有許多文章報道，在以前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，在2,252個先證者組成的家系中，與其他方言相比，在操廣東話的家系中鼻咽癌呈現(xiàn)更明顯的家族聚集現(xiàn)象。針對32個廣東鼻咽癌家系運用全基因組連鎖分析，我們把鼻咽癌的易感區(qū)域定位在染色體4p15.1-q12。后來，加進更多的微衛(wèi)星標記和單核苷

6、酸多態(tài)性標記，并對該區(qū)域的基因進行篩選，目標集中在外顯子，啟動子和外顯子-內(nèi)含子的交界處。我們發(fā)現(xiàn)一新基因LOC344967的上游調節(jié)區(qū)攜帶的一個SNP位點-32G/A，在我們研究的31、34、62和43號核心家系中和疾病表型共分離。我們基于前期大量遺傳學分析認為LOC344967基因可能與鼻咽癌發(fā)病高度相關。
　　 盡管其生物學功能仍未明確，RT-PCR結果顯示在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種癌組織和鼻咽癌細胞系中都檢測到它轉錄水平的表

7、達。LOC344967基因廣泛的組織分布說明它可能具有重要的生物學功能。生物信息學分析顯示LOC344967可能屬于硫酯酶超家族，與人BACH蛋白高度同源。
　　 硫酯酶在從低等到高等生物中具有高度的進化保守性，在不同組織都具有廣泛的活性。真核生物中包括溶酶體，過氧化物酶體，線粒體及胞質中都能檢測到硫酯酶活性。至今為止，許多硫酯酶的功能并不非常明確，一般認為它對脂肪代謝起到調控作用，參與細胞內(nèi)物質的轉運，參與細胞內(nèi)吞作用。硫酯酶

8、還調節(jié)了某些蛋白的酰化狀態(tài)，包括信號傳導蛋白及細胞內(nèi)定位。硫酯酶II還可作為兔乳腺癌發(fā)生和人類腫瘤中乳腺來源的標記[13，14]。Liu，L.X報道硫酯酶可調節(jié)HIV病毒的Nef誘導CD4陽性T細胞下調[15]。某些硫酯酶的表達異常有可能導致細胞及組織的異常筋攣和增殖，從而引發(fā)各種相關疾病，如炎癥，免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤的發(fā)生。
　　 脂肪酸代謝是動植物中廣泛存在的生理過程。脂肪酸參與細胞內(nèi)能量的儲存、胞膜的組成、信號轉導的級聯(lián)反應

9、、蛋白質酰基化作用、細胞極化和遷移等重要過程。大量臨床、基礎研究表明腫瘤具有獨立的合成脂肪酸進行能量補充、胞膜磷脂合成的能力，而且這種合成似乎并不依賴存在于正常細胞中的可調節(jié)脂肪酸合成的調節(jié)信號。腫瘤的內(nèi)源性脂肪酸合成為腫瘤細胞的生長提供了極其重要的脂肪酸來源。
　　 因而，我們在LOC344967與硫酯酶活性、脂肪酸代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系上做更深入的研究。
　　 方法：通過RT-PCR方法從鼻咽上皮細胞系NP69中擴

10、增LOC344967及hBACHa的cDNA序列，插入各種單獨表達或融合表達的表達載體。體外瞬時表達后，檢測細胞的硫酯酶活性及各項與細胞增殖相關參數(shù)；檢測LOC344967瞬時表達后脂肪酸組成改變，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)產(chǎn)生水平及細胞ATP水平的變化。
　　 構建LOC344967轉基因小鼠，觀察該轉基因小鼠的表型及各器官表達情況，及各器官的脂肪酸組成。通過小鼠尾靜脈注射B16小鼠黑色素

11、腫瘤細胞，觀察B16細胞在轉基因小鼠肺中的實驗性轉移情況及其與野生型小鼠的區(qū)別。
　　 結果：通過全細胞酶活檢測，我們證實LOC344967雖然與硫酯酶hBACHa高度同源，但由于在N端存在缺失，導致硫酯酶活性的喪失。有意思的是，LOC344967可以通過誘導hBACH的降解，抑制內(nèi)源性硫酯酶活性的作用，從而上調Acyl-CoA水平，進而導致細胞ATP水平上升，活性氧ROS濃度升高。
　　 相反，通過hBACHa的過表達

12、則導致ATP水平下調及活性氧ROS濃度降低。相應的MTT實驗及流式結果證明了F/LOC能促進細胞增殖，而hBACHa則抑制細胞增殖。
　　 同時，我們還發(fā)現(xiàn)F/LOC在細胞中高表達能導致細胞總脂肪酸中c9，t11和t10，c12兩種共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)亞型含量顯著上升。這種功能性脂肪酸可以通過上調活性氧的水平，促使細胞自噬的發(fā)生，這也可能是促進細胞ATP水平上升的機制之一。

13、>　　 在轉基因小鼠中，F(xiàn)/LOC主要表達于腎和肺中，并導致這些組織中c9，t11和t10，c12兩種亞型的共軛亞油酸(CLAs)含量顯著升高：在尾靜脈注射B16腫瘤細胞的實驗性肺轉移實驗中，在F/LOC轉基因雜合子小鼠的肺中形成的轉移灶明顯比野生型小鼠少，提示了CLAs的升高可以抑制腫瘤轉移的發(fā)生。
　　 結論：我們首次證明了LOC344967編碼的蛋白具有抑制細胞內(nèi)硫酯酶活性的功能，并能改變脂肪酸的組成，明顯升高共軛亞油酸