鼻咽癌候選易感基因LOC344967啟動(dòng)子區(qū)功能性變異的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文鼻咽癌候選易感基因LOC344967啟動(dòng)子區(qū)功能性變異的研究姓名：蔣日成申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：曾益新20060501中山大學(xué)博=匕學(xué)位論文鼻咽癌候選易感基因LOC344967啟動(dòng)子區(qū)功能性變異的研究這些研究結(jié)果提示可能很多基因參與了不同的鼻咽癌發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或細(xì)胞功能的活化，它們的協(xié)同作用導(dǎo)致了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，而這與腫瘤的多因素遺傳模式是吻合的。對(duì)于鼻咽癌的家族聚集性已經(jīng)有許多文章報(bào)道，在以前

2、的研究中我們發(fā)現(xiàn)，在2，252個(gè)先證者組成的家系的中，與其他方言相比，在操廣東話的家系中鼻咽癌呈現(xiàn)更明顯的家族聚集現(xiàn)象。針對(duì)32個(gè)廣東鼻咽癌家系運(yùn)用全基因組連鎖分析，我們把鼻咽癌的易感區(qū)域定位在染色體4p151q12，后來，加進(jìn)更多的微衛(wèi)星標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，我們進(jìn)一步把易感區(qū)域從1421cM縮小到829cM，定位于染色體4p14一pl1。為了進(jìn)一步鑒定與鼻咽癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或者影響到基因功能的變異，我們對(duì)該區(qū)域的基因進(jìn)行篩

3、選，目標(biāo)集中在外顯子，啟動(dòng)予和外顯子一內(nèi)含子的交界處。我們發(fā)現(xiàn)新基因LOC344967的上游調(diào)節(jié)區(qū)攜帶的一個(gè)SNP位點(diǎn)一32G／A，在我們研究的31、34、62和43號(hào)家系中和疾病表型共分離。對(duì)包括該位點(diǎn)在內(nèi)的LOC344967啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析后，我們發(fā)現(xiàn)32G／A變異導(dǎo)致了激活蛋白1(activatingproteinl，APl)結(jié)合位點(diǎn)的產(chǎn)生。方法：運(yùn)用生物信息學(xué)方法尋找與LOC344967—32G／A位點(diǎn)相關(guān)的信息。用電泳遷移改

4、變實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定一32A變異產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與API的結(jié)合能力。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體確定LOC344967—32A的變異對(duì)LOC344967的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力。采用RT—PCR方法確定LOC344967基因在不同癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，用RealtimeRT—PCR和Westernblotting方法確定32A變異對(duì)LOC344967表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果：電泳遷移改變實(shí)驗(yàn)

5、證明攜帶有一32A變異的LOC344967APl一樣寡核苷酸探針同樣可以與HEK293細(xì)胞核蛋白提取物發(fā)生結(jié)合，在與APl一致性寡核苷酸序列相同的位置形成致密電泳條帶。攜帶有一32G的LOC344967寡核苷酸探針與HEK293細(xì)胞核蛋白提取物混合反應(yīng)后，在與APl一致寡核苷酸序列相同的位置未見形成致密電泳條帶。當(dāng)加入cJun和c—Fos的特異性抗體時(shí)，攜帶有一32A的LOC344967APl一樣寡核苷酸探針并nAPl一致寡核苷酸序列均