西北地區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的高通量表達(dá)篩選和功能研究.pdf

1、背景和目的:
　　遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因,其分子機制有待深入探索。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟相互作用的復(fù)雜過程。高通量的表達(dá)篩選是發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的重要方法,但目前鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選大多來源于細(xì)胞系,無法真實模擬體內(nèi)的情況,另外,大多數(shù)的研究來自于鼻咽癌高發(fā)區(qū),非高發(fā)區(qū)的研究相對較少。本研究首次利用鼻咽癌轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本,利用全基因組表達(dá)譜芯片芯片篩選中國西北地區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,并分別在細(xì)胞系的mR

2、NA、蛋白水平及組織標(biāo)本中進(jìn)行表達(dá)和功能驗證。本研究將有望發(fā)現(xiàn)多個新的非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)重要基因,為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的臨床診治提供新的靶點。
　　方法:
　　1、臨床標(biāo)本選取西北地區(qū)以轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀的和隨訪滿3年無轉(zhuǎn)移的鼻咽癌原發(fā)灶組織各3例,采用含41,000個人類功能基因的安捷倫全基因組表達(dá)譜芯片檢測,比較兩組基因表達(dá)譜的差異性,篩選具有2倍以上表達(dá)差異的基因,使用GoMiner軟件分析差異基因的功能;使用KEGG軟件對差

3、異基因進(jìn)行通路分析。
　　2、實時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)染色的方法對候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的進(jìn)行mRNA及蛋白水平的驗證,以確定芯片結(jié)果的可靠性,同時利用Westernblot檢測不同轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系(5-8F和6-10B細(xì)胞)各候選基因的表達(dá)情況。
　　3、采用siRNA技術(shù)干擾候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MAZ、DMBT1基因在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系6-10B中的表達(dá),WesternBlot驗證轉(zhuǎn)染效果。利用細(xì)胞

4、劃痕實驗、Transwell實驗觀察5-8F、6-10B細(xì)胞株遷移、侵襲能力的變化,探討MAZ、DMBT1對5-8F及6-10B細(xì)胞系轉(zhuǎn)移表型的影響。
　　4、收集鼻咽癌患者的組織標(biāo)本,利用免疫組化檢測MAZ和DMBT1基因的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床資料的相關(guān)性,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,采用獨立樣本的t檢驗和秩和檢驗,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組基因表達(dá)譜結(jié)果:按差異

5、倍數(shù)2倍,FDR<10％標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織相比,有2314個基因上調(diào),2417個基因下調(diào)。采用差異倍數(shù)10倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選,70個基因上調(diào),57個基因下調(diào)。本研究首次發(fā)現(xiàn)MAZ、DMBT1、SFTPB三個基因在非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組的差異表達(dá),是潛在的鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
　　2、通過GoMiner和KEGG對差異倍數(shù)達(dá)2倍以上的基因進(jìn)行GO分析和通路分析發(fā)現(xiàn):上調(diào)基因共參與501個BP分類,參與12

6、5個CC分類,參與98個MF分類;下調(diào)基因參與333個BP分類,37個CC分類,72個MF分類。Pathway分析顯示轉(zhuǎn)移上調(diào)基因共參與35條pathway,下調(diào)基因共參與29條pathway,P值均<0.05。
　　3、實時熒光定量PCR和免疫組化檢測組織中MAZ、DMBT1、SFTPB的表達(dá)與芯片結(jié)果具有良好的一致性,高轉(zhuǎn)移組織中MAZ表達(dá)上調(diào),DMBT1、SFTPB下調(diào)。WesternBlot檢測高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系5-8F細(xì)胞中M

7、AZ的表達(dá)上調(diào),DMBT1、SFTPB表達(dá)下調(diào),低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系6-10B細(xì)胞中MAZ表達(dá)下調(diào),DMBT1、SFTPB上調(diào)。
　　4、用MAZ和DMBT1的siRNA分別轉(zhuǎn)染5-8F、6-10B細(xì)胞,WesternBlot檢測證實轉(zhuǎn)染后其蛋白表達(dá)明顯降低。劃痕實驗和Transwell實驗表明轉(zhuǎn)染MAZsiRNA后,5-8F細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯減弱;轉(zhuǎn)染DMBT1siRNA后,6-10B細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增強。
　　5、免疫

8、組化檢測MAZ和DMBT1表達(dá)與鼻咽癌臨床資料相關(guān)性,結(jié)果提示:在遠(yuǎn)轉(zhuǎn)組、N分期晚、T分期晚、未分化型癌的病人中,MAZ表達(dá)較高(P<0.05),DMBT1在未轉(zhuǎn)移組、分化型,其表達(dá)量較高(P<0.05)。SFTPB在轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組、不同T、N、臨床分期、病理類型之間表達(dá)差異未達(dá)統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　通過全基因組芯片篩選技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)MAZ、DMBT1、SFTPB這三個基因可能是西北非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因

9、。我們進(jìn)一步對MAZ和DMBT1基因進(jìn)行了深入研究。其中,MAZ是潛在的促鼻咽癌轉(zhuǎn)移基因,其在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高,下調(diào)MAZ的表達(dá),可以顯著抑制高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。DMBT1是潛在的鼻咽癌轉(zhuǎn)移抑制基因,其在低轉(zhuǎn)移的組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào),下調(diào)DMBT1的表達(dá)可以顯著促進(jìn)低轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。臨床資料的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):MAZ在未分化鼻咽癌的表達(dá)水平較高,且其高表達(dá)和鼻咽癌的淋巴結(jié)和