VIGS技術(shù)高通量篩選棉花抗黃萎病相關(guān)基因.pdf

1、棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的一種土傳真菌維管束病害，嚴(yán)重危害棉花的生產(chǎn)，被稱為“棉花的癌癥”。棉花黃萎病危害嚴(yán)重，難以防控，很大程度上歸咎于抗黃萎病抗源的缺乏，及對(duì)棉花抗黃萎病分子機(jī)理研究的欠缺，再加上生產(chǎn)上缺少行之有效的防控技術(shù)和措施。從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的特征和機(jī)制，依然是揭示棉花抗黃萎病分子機(jī)理，提高棉花對(duì)黃萎病抗性的基礎(chǔ)工作。然而長(zhǎng)期以來，因受到研究材料的限制，以及研究手段的欠缺，從基因水平上去研究和探索棉花抗黃萎病分子

2、機(jī)理難度很大。病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）是利用反向遺傳學(xué)策略揭示植物基因功能的重要技術(shù)之一，為從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的分子機(jī)制提供了新的契機(jī)。
　　本研究以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花病害組選育的陸地棉(Gossypium hirsutum)抗黃萎病品系—中植棉KV3為材料，在實(shí)驗(yàn)室前期抑制差減雜交和基因芯片分析的基礎(chǔ)上，初步挑選出106個(gè)可能與棉花抗黃萎

3、病相關(guān)的基因，并用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）研究這些基因在棉花抗黃萎病中的作用和功能。所利用的VIGS載體為棉葉皺縮病毒（Cotton leaf crumple virus,CLCrV）改造?？偣渤晒?gòu)建了6大類，62個(gè)VIGS基因載體。所構(gòu)建的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，用農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)，靶向性沉默相對(duì)應(yīng)的基因，然后用傷根法接種黃萎病菌，檢測(cè)基因沉默棉花植株對(duì)棉花黃

4、萎病抗性的變化情況。由此，利用VIGS這一反向遺傳學(xué)的技術(shù)高通量地篩選出棉花抗黃萎病相關(guān)基因，為棉花抗黃萎病機(jī)制的研究，以及棉花抗病品種分子選育提供基礎(chǔ)性工作。主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用CLCrV誘導(dǎo)的基因沉默體系，靶向性沉默葉綠素合成相關(guān)基因CHLI和CLA1，基因沉默后植株的葉片表現(xiàn)出明顯的黃化和白化表型；還確認(rèn)了目的基因沉默植株中，目的基因的表達(dá)量也明顯降低；且空載體轉(zhuǎn)化對(duì)照植株與野生型植株對(duì)黃萎病菌的抗性無明顯差異；

5、說明該體系在中植棉KV3中可沉默目的基因，用于目的基因功能的研究；
　　2.運(yùn)用VIGS技術(shù)高通量篩選棉花抗黃萎病相關(guān)基因，三輪重復(fù)試驗(yàn)篩選出8個(gè)與棉花抗、感黃萎病相關(guān)的基因。其中6個(gè)基因[Gh39（bZIP）、Gh24（GRAS）、Gh58（WRKY）、Gh55（EIN2）、Gh114（XTH）、Gh97（Drigent-like protein）]正調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性，2個(gè)基因[Gh15（bZIP）、Gh31（NAC5）]

6、負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性；
　　3.對(duì)其中的3個(gè)基因進(jìn)行功能注釋與表達(dá)特性分析。結(jié)果顯示：Gh55為乙烯信號(hào)途徑中的正向調(diào)控因子EIN2，利用VIGS技術(shù)沉默該基因，沉默植株接種黃萎病菌后，病癥明顯加重，說明該基因是一棉花黃萎病的正調(diào)控基因；沉默 Gh97（Dirigent-like protein）的植株接種黃萎病菌后，癥狀顯著加重，聚類分析結(jié)果顯示該基因?qū)儆贒IRb/d家族，且在根部的表達(dá)量很高，這些結(jié)果說明，Gh97可能在根