棉花抗黃萎病相關(guān)基因GbSTK和GhGST的遺傳轉(zhuǎn)化與表達(dá)研究.pdf

1、課題組在前期研究工作中分別從抗黃萎病品種海島棉Pima90-53和陸地棉冀棉20中克隆得到抗黃萎病相關(guān)基因GbSTK(絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶基因)和GhGST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因),構(gòu)建了基因超表達(dá)載體pGN-GbSTK和pBI121-GhGST,并在擬南芥和煙草上初步驗(yàn)證了基因的功能。在此基礎(chǔ)上,本研究采用Realtime-PCR技術(shù),分析不同抗病棉花品種在黃萎病菌誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)差異及黃萎病菌脅迫下T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥中GbSTK

2、的表達(dá)變化;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化棉花,以獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.Realtime-PCR結(jié)果顯示,GbSTK與GhGST在不同抗性棉花品種中的表達(dá)變化具有明顯差異,在抗病品種Pima90-53中基因的表達(dá)變化最大,次之是抗病品種冀棉20,在感病品種邯208中的表達(dá)變化最小,說(shuō)明GbSTK和GhGST參與了黃萎病抗性反應(yīng)。
　　 2.Realtime-PCR結(jié)果顯示,在黃萎病菌誘導(dǎo)下

3、,GbSTK在T3代轉(zhuǎn)pCamGbSTK:GFP擬南芥中的表達(dá)有明顯變化,在接菌后24h表達(dá)量最高,約為Oh的4倍,而野生型擬南芥中未檢測(cè)到GbSTK的表達(dá)。說(shuō)明GbSTK參與了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗黃萎病反應(yīng)。
　　 3.以陸地棉邯208為材料,研究固化劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和抗生素篩選對(duì)莖尖生根和成苗的作用,以及菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明,以phytagel為固化劑,0.1mg/L6-BA+0.

4、1mg/LIAA最適于莖尖不定芽的誘導(dǎo),1/2MSB+O.1mg/LIAA+0.1mg/LNAA誘導(dǎo)生根效果最佳。在75mg/LKan篩選下,以O(shè)D600為0.9的農(nóng)桿菌菌液侵染25min,22℃共培養(yǎng)48h,卡那篩選陽(yáng)性率最高。采用該轉(zhuǎn)化體系將GhGST轉(zhuǎn)化邯208,經(jīng)PCR檢測(cè)獲得了3株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
　　 4.通過(guò)研究無(wú)菌苗培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時(shí)間、下胚軸處理方式和農(nóng)桿菌種類(lèi)對(duì)出愈率的影響,結(jié)果表明,無(wú)菌苗暗培養(yǎng)3d,切下下胚