氡染毒動(dòng)物差異表達(dá)基因的高通量篩選.pdf

1、目的：在建立氡染毒動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，篩選和鑒定氡染毒動(dòng)物外周血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和氣管—支氣管上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因，為探討氡致肺癌的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。 方法：實(shí)驗(yàn)用HD—3型多功能移動(dòng)式氡室，對(duì)BALB/c小鼠和Wistar大鼠動(dòng)態(tài)吸入染毒，建立動(dòng)物模型。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸入氡及其子體的累積劑量分為實(shí)驗(yàn)組（100WLM）和對(duì)照組（室內(nèi)本底濃度，0．8WLM），每組4只動(dòng)物。染毒時(shí)間每天8小時(shí)，每周6天。通過觀察小鼠外周血、骨髓細(xì)胞和

2、大鼠外周血的早期生物學(xué)指標(biāo)以及氣管—支氣管的病理學(xué)改變，建立動(dòng)物模型。取小鼠外周血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和大鼠氣管—支氣管上皮細(xì)胞，抽提總RNA，采用SMART cDNA和抑制性消減雜交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）技術(shù)，構(gòu)建差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù)，TA克隆，選取含有插入cDNA片斷的克隆進(jìn)行反向Northern雜交篩選上調(diào)或下調(diào)的陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果在GenBank Blast

3、中進(jìn)行同源性檢索，同源性高的序列進(jìn)行功能分析和生物信息學(xué)分析，同源性低的序列提交GenBank。用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)最終得到的部分差異片斷進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：動(dòng)物氡染毒100WLM后，小鼠外周血和骨髓細(xì)胞出現(xiàn)計(jì)數(shù)改變、脂質(zhì)過氧化損傷和遺傳學(xué)改變；大鼠外周血SOD活性降低和MDA含量升高，組織學(xué)檢查出現(xiàn)明顯的支氣管炎性浸潤(rùn)。運(yùn)用SMART cDNA和抑制性消減雜交成功構(gòu)建了消減cDNA文庫(kù)。挑取白斑1004個(gè)，獲得837個(gè)含有插入

4、片斷的單克隆，進(jìn)行反向Northern雜交，分析基因的上調(diào)或下調(diào)水平。選取差異表達(dá)克隆126個(gè)進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析，最終獲得44條已知功能或有注釋差異基因片斷，39條未知功能的已知差異基因片斷，24條重復(fù)差異基因，19條未知EST，其中未知EST提交至GenBank，獲得注冊(cè)號(hào)。44條已知功能或有注釋的差異基因的結(jié)果提示，篩選出的差別表達(dá)基因涉及氧化損傷、細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷和腫瘤發(fā)生等多方面的功能。 結(jié)論：