高通量篩選和鑒定具ACC脫氨酶的細菌.pdf

1、植物在遭受脅迫時產(chǎn)生乙烯。高濃度乙烯抑制植物生長。具1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)脫氨酶的細菌能通過降解乙烯合成前體ACC而降低植物產(chǎn)生乙烯的水平。在惡化的農(nóng)田生態(tài)下，接種具ACC脫氨酶的細菌往往比接種具其他促植物生長特性的細菌，如固氮菌，更易產(chǎn)生促植物生長的效應。于是，本研究致力于從固氮菌和能在無氮培養(yǎng)基上生長的細菌中篩選具ACC脫氨酶的細菌并應用于農(nóng)作物生產(chǎn)。
　　 分離具ACC脫氨酶細菌通用的方法是用以ACC為唯一氮源的

2、基本培養(yǎng)基來篩選，但對于能在無氮培養(yǎng)基上生長的細菌，這種篩選方法顯然不夠靈敏。而對于從大量能在無氮培養(yǎng)基上生長的細菌中篩選具ACC脫氨酶的細菌則需要新的高通量篩選方法。本研究以乙二醇為溶劑加入抗壞血酸配制茚三酮試劑，在沸水浴上加熱聚丙烯96孔煙囪型PCR板中的反應液，測定反應后液體在570 nm處的吸光值計算ACC的濃度，建立了高通量的茚三酮-ACC比色法用于測定細菌對ACC的消耗。接著，以43個從甘蔗分離的固氮菌和68個從玉米分離的能

3、在無氮培養(yǎng)基上生長的菌株為材料，快速篩選到6個能消耗ACC的細菌，用2，4-二硝基苯肼比色法檢測證實這6個菌株都具有ACC脫氨酶活性。因此，高通量茚三酮-ACC比色法適合高通量篩選具ACC脫氨酶活性細菌。用該法進一步從153個從甘蔗分離的能在無氮培養(yǎng)基上生長的菌株和268個從水稻或東南景天分離的能在以ACC為唯一氮源的基本培養(yǎng)基上生長的菌株中篩選出52個具ACC脫氨酶活性的細菌。
　　 在分子水平鑒定具ACC脫氨酶的細菌是通過用

4、簡并引物擴增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因acdS或用DNA雜交檢測acdS。已發(fā)表的研究往往參考少數(shù)菌株的acdS序列設(shè)計了簡并引物，擴增特異性差，還不如菌落雜交有效；而菌落雜交也需要針對不同類型的acaS用相應類型的探針，探針的廣譜性弱。本研究根據(jù)ACC脫氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸保守性分析及其與同源蛋白D-半胱氨酸脫巰基酶在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，用CODEHOP法則設(shè)計了廣譜特異的acdS簡并引物：CodehopACCf1、CodehopACCf2、C

5、odehopACCf3和CodehopACCr，并成功擴增得到所有58株具ACC脫氨酶細菌的acdS基因片段，實現(xiàn)了在分子水平高通量鑒定具ACC脫氨酶的細菌。在這58株細菌的acdS基因片段中，有一些歸于新的acdS類群。而且，通過構(gòu)建所有已知具有ACC脫氨酶活性細菌的acdS和相應16S rDNA的系統(tǒng)進化樹揭示了acdS存在廣泛的基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
　　 本研究還對從玉米和水稻分離篩選的43株具ACC脫氨酶細菌的多種促植物生

6、長特性包括分泌IAA、固氮、溶磷、分泌嗜鐵素和拮抗病原真菌做了分析，發(fā)現(xiàn)這些細菌還具有一種以上其他促植物生長的特性，顯示出促植物生長的應用潛能。其中16株伯克氏菌不僅能解磷和分泌嗜鐵素，而且具有廣譜的拮抗病原真菌的能力，但這些伯克氏菌在親緣關(guān)系上與包含機會致病菌的洋蔥伯克氏菌群接近。雖沒有從這些伯克氏菌中檢測到BCESM致病因子，但多數(shù)菌株對洋蔥有害?；蛩睫D(zhuǎn)移acdS有可能使病原菌具有了ACC脫氨酶。因此，在應用具ACC脫氨酶活性細