解鹽促生菌Rs-5的ACC脫氨酶基因克隆及表達(dá)研究.pdf

1、為解決新疆棉田長期滴灌出現(xiàn)的土壤次生鹽漬化問題，本文以新疆不同生態(tài)環(huán)境的次生鹽漬化土壤中自行篩選得到幾株對棉花種子發(fā)芽和苗期生長具有顯著促生功能的解鹽促生菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca Rs-5（Genebank登錄號為EF551363）及惡臭假單胞菌Pseudomonas putida Rs-198（Genbank登錄號為FJ788425）為對象，進(jìn)行了ACDS基因的克隆、載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究。主要內(nèi)容如下：

2、 ⑴根據(jù)Genbank上已報道的ACC脫氨酶基因序列設(shè)計并合成一對簡并引物，以產(chǎn)酸克雷伯氏菌Rs-5基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得一條約1.0kb的特異片段。序列分析表明此基因具有完整的開放閱讀框，編碼區(qū)全長為1017bp，共編碼338個氨基酸殘基。由該基因（命名為Koacds）的DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與陰溝腸桿菌Enterobacterc loacae UW4和CAL2的ACC脫氨酶同源性分別為95.56％和96.75％。

3、 ⑵將上述基因與大腸桿菌-假單胞菌穿梭質(zhì)粒pDSK519連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pDSK519-Koacds并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，獲得的重組菌株命名為BL21-Koacds。全細(xì)胞蛋白電泳分析表明ACC脫氨酶基因已在重組基因工程菌中成功表達(dá)，且利用0.4mM的IPTG于25℃誘導(dǎo)5h后，蛋白表達(dá)量最大，比酶活可達(dá)0.192±0.042U/mg。 ⑶通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到惡臭假單胞菌Rs-198并對轉(zhuǎn)化效率的影響因素

4、進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，以O(shè)D600值為0.5的惡臭假單胞菌P.putida Rs-198細(xì)胞，在低溫條件下制備感受態(tài)細(xì)胞（濃度為4.6×1012/ml），并以0.3M的蔗糖為電轉(zhuǎn)化介質(zhì)，在13kV/cm的場強(qiáng)下電擊可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，最高可達(dá)1.3×107個轉(zhuǎn)化子/μgDNA。重組菌株198-Koacds在28℃經(jīng)0.4mM IPTG誘導(dǎo)5h后，SDS-PAGE電泳檢測其蛋白表達(dá)量最大，此時比酶活為0.167±0.028U/mg。

5、 ⑷用轉(zhuǎn)入ACC脫氨酶的重組菌株198-Koacds處理棉花種子，通過檢測其發(fā)芽率、干重及株高等指標(biāo)驗證重組菌株的解鹽促生能力。結(jié)果顯示在NaCl濃度為0.7％時，產(chǎn)酸克雷伯氏菌Rs-5、惡臭假單胞菌Rs-198及重組菌株198-Koacds使棉花的發(fā)芽率分別平均提高了15.9％、16.8％及16.7％；棉花的干重分別平均提高了30.6％、31.0％及32.1％；棉花的株高分別平均提高了10.8％、13.6％及12.2％。利用野生型

6、惡臭假單胞菌P.putida Rs-198與重組菌株198-Koacds ACC脫氨酶粗酶液混合處理棉花后，其發(fā)芽率提高了28.6％，表明ACC脫氨酶具有一定的解鹽促生功能。 ⑸重組菌株在LB培養(yǎng)基中及棉花根部的質(zhì)粒穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：空質(zhì)粒pDSK519與帶有ACDS基因的重組質(zhì)粒pDSK519-Koacd在LB培養(yǎng)基中經(jīng)連續(xù)傳代60小時后質(zhì)粒丟失率基本達(dá)到穩(wěn)定，在連續(xù)培養(yǎng)96小時后未丟失質(zhì)粒所占百分比分別為68％和65％；而