TIP30基因對喉癌肝癌耐藥及EMT的作用研究.pdf

1、喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國約占全身腫瘤的1％-2%，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的11%～22%，化療是重要的治療手段之一，近年來根據(jù)NCCN(National Comprehensive Cancer Network美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡)制定的標準化療治療方案未能明顯提高其5年生存率，其重要因素之一就是腫瘤發(fā)生了耐藥性，最終導致了治療的失敗。肝癌是第三大腫瘤殺手，2000年約有548，600人死于肝癌，是我國最常見的惡性腫

2、瘤之一，在我國腫瘤死因排名中位列第2。雖然目前肝癌早期的診斷率有所提高，但由于早期肝癌臨床癥狀不明顯，臨床上發(fā)現(xiàn)時已至晚期，且由于肝臟是全身血供及淋巴管最為豐富的臟器，腫瘤極易發(fā)生轉移，這是肝癌預后較差的主要原因之一。為提高上述兩種腫瘤的臨床治療效果，有必要對其轉移及耐藥的分子機制進行深入研究，為其診斷和治療提供新靶點、新策略。
　　TIP30，又稱CC3，是30kd的轉錄輔助因子，最早發(fā)現(xiàn)于肺癌，是利用RNA差異顯示技術比較高轉

3、移性和低轉移腫瘤的時發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。在正常組織中TIP30均有一定的表達量，而在腫瘤組織中表達相對較低，如胰腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌、結腸癌及肝癌等腫瘤中TIP30表達均顯著下調。因其有絲／蘇氨酸激酶的活性，RNA聚合酶Ⅱ最大亞基可以和TIP30結合并被其磷酸化C末端的七肽基序，在一定的微環(huán)境下調節(jié)與細胞增殖、凋亡等相關基因的表達，與多種腫瘤的轉移和預后密切相關。
　　過表達TIP30可抑制腫瘤血管生成、細胞外基質降解、降低細胞的

4、侵襲和遷移能力，此外TIP30還可與ETS1蛋白N端相互作用，調控骨橋蛋白轉錄，抑制其表達，從而調控肝癌細胞的轉移。新近研究表明TIP30可作為索菲拉尼及microRNA-10b的靶基因，實現(xiàn)其對腫瘤細胞轉移的調控。在腫瘤細胞中，TIP30基因往往呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，致使TIP30表達下降，最終導致腫瘤發(fā)生了侵襲和轉移。此外，在肝癌細胞中TIP30可以通過調控凋亡相關基因BCL-2的表達增加化療效果，提高化療藥物氟尿嘧啶對腫瘤的殺傷力，延

5、長動物帶瘤生存的時間。上述研究均提示TIP30在腫瘤細胞中具有抑制腫瘤轉移，提高化療敏感性的作用，但是在喉癌中TIP30的具體作用仍為見相關文獻報道，且TIP30調控轉移及耐藥的具體作用機制仍然有待于我們進一步深入的研究。
　　利用免疫組化技術，我們檢測了104例喉癌病人的腫瘤及癌旁組織中TIP30的蛋白表達情況，分析了多項臨床指標與TIP30蛋白質表達的相關性，通過動物模型成功獲得了了喉癌耐藥細胞株DSCs，并在此基礎上對TIP

6、30調控喉癌及肝癌耐藥及EMT的生物學功能進行了進一步研究。
　　第一部分 TIP30在喉癌組織中的表達及與臨床指標的關系
　　采用Envision法檢測TIP30在104例喉癌及癌旁組織中表達情況，按照免疫組化評分的標準，將組織中TIP30的表達分為兩組：高表達和低表達組。TIP30蛋白呈棕黃色顆粒分在胞漿及胞核中均有著色，但以胞漿為主。在104例病人中，79例中TIP30呈低表達，25例病人呈高表達。利用分層分析法檢驗了

7、TIP30、性別、年齡、臨床分期、分化程度與患者預后的關系，結果顯示TIP30的表達與喉癌病人的預后密切相關（p＜0.001）。Kaplan–Meier生存曲線分析TIP30蛋白表達量與喉癌患者總體生存率的關系，發(fā)現(xiàn)TIP30的表達與喉癌患者預后關系密切相關，TIP30高表達的患者生存時間明顯高于低表達患者。
　　第二部分 RNA-Seq分析TIP30基因表達在頭頸部鱗癌中與細胞化藥耐藥的關系以及體內藥物篩選喉癌耐藥細胞株（DSC

8、s）的功能鑒定及TIP30在DSCs中的表達
　　利用RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)結合11株頭頸部鱗狀細胞癌化藥敏感性的結果，分析TIP30基因與頭頸部鱗癌細胞化藥耐藥的關系。結果顯示在11株頭頸部鱗狀細胞癌中Hep2細胞及58F細胞TIP30呈高表達，其他幾種細胞表達基本一致。耐藥實驗中TIP30高表達的Hep2細胞及58F細胞化藥耐藥能力較其他細胞顯著降低，提示TIP30基因的表達可能與頭頸部鱗狀細胞癌的耐藥密切相關。我們進一步采

9、用順鉑體內給藥的方法獲得喉癌耐藥細胞株DSCs。通過RT-PCR檢測了DSCs耐藥基因ABCG2,ABCC2,ABCB1的表達；體外耐藥實驗檢測其耐藥性變化；RT-PCR檢測自我更新相關基因Bmi1，Oct4，Nanog的表達變化；懸浮成球實驗檢測其成球及自我更新能力的變化；克隆形成實驗檢測其增殖能力的變化；有限稀釋成瘤檢測其致瘤性能力的變化；免疫組化及qRT-PCR法檢測TIP30的表達變化。DSCs較親本喉癌細胞株Hep2具有更強的

10、耐藥、增殖、自我更新及致瘤能力，同時在DSCs中TIP30幾乎不表達。
　　第三部分 TIP30對喉癌及肝癌耐藥、轉移作用的研究
　　在肝癌及喉癌中根據(jù)內源性TIP30的表達進行相關干預，進行如下實驗：過RT-PCR檢測了其耐藥基因ABCG2,ABCC2,ABCB1的表達；體外耐藥實驗檢測其耐藥性變化；RT-PCR檢測自我更新相關基因Bmi1，Oct4，Nanog的表達變化；懸浮成球實驗檢測其成球及自我更新能力的變化；克隆形

11、成實驗檢測其增殖能力的變化；有限稀釋成瘤檢測其致瘤性能力的變化；裸鼠荷瘤生存時間變化；成瘤體積大小的變化；腫瘤局部浸潤的變化；免疫熒光及Western法檢測EMT相關Marker的表達變化；結果顯示：干擾TIP30的表達后，腫瘤細胞具有更強的耐藥、增殖、自我更新、致瘤能力，且導致腫瘤細胞發(fā)生EMT轉換。過表達TIP30后腫瘤細胞對化療藥物敏感性增加，增殖、自我更新及致瘤能力減弱，且使得腫瘤細胞上皮表型標志物顯著增加，間充質表型標志物顯著

12、降低。
　　第四部分 TIP30調控喉癌及肝癌細胞耐藥及轉移機制的研究
　　在喉癌及肝癌細胞中干預TIP30的表達后，利用RT-PCR、Western-blot，免疫熒光等方法檢測GSK3β/β-Catenin信號通路關鍵分子GSK3β，β-Catenin及EMT轉錄因子Snail的表達及定位變化。共轉染干預TIP30的慢病毒及β-Catenin、Snail的過表達質?；蛐「蓴_Rna，觀察細胞耐藥能力及EMT相關指標的變化情

13、況。染色質免疫共沉淀方法檢測TIP30與核轉運因子importin-β的結合情況及其對Snail核定位影響。結果提示：干擾TIP30的表達后GSK3β磷酸化程度增高，β-Catenin磷酸化程度下降，GSK3β/β-Catenin信號通路異常激活，而過表達TIP30后GSK3β/β-Catenin信號通路活性受到抑制，TIP30可與Snail競爭結合importin-β抑制Snail的入核。
　　1.TIP30在喉癌中的表達水平與

14、喉鱗狀細胞癌患者的預后及臨床分期密切相關，TIP30高表達的喉癌患者預后較好，TIP30可以作為一個判斷喉鱗狀細胞癌患者預后的重要指標。
　　2.RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)結合11株頭頸部鱗狀細胞癌分析結果顯示TIP30基因表達與頭頸部鱗癌的化藥耐藥相關。通過體內給藥的動物模型，可以成功獲得喉鱗狀細胞癌耐藥細胞株DSCs，與親本細胞株Hep2比較，DSCs細胞具有更強的增殖、成瘤、耐藥能力，且TIP30呈低表達，為喉癌耐藥的進一步研

15、究奠定了基礎。
　　3.TIP30能調控腫瘤細胞的耐藥性，過表達TIP30可以增加化療藥物的作用，延長小鼠帶瘤生存的時間。
　　4.TIP30能調控腫瘤細胞的侵襲、遷移，并能調控腫瘤轉移早期事件EMT的進程，過表達TIP30能抑制EMT及腫瘤轉移，敲除TIP30能促進腫瘤細胞的EMT進程的發(fā)生致使腫瘤發(fā)生侵襲轉移。
　　5.TIP30能調控信號通路GSK3β/β-Catenin的活性，并通過該通路調控腫瘤的耐藥性。