版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞在某些條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)表型細(xì)胞的過程。研究已證實(shí) EMT在腎纖維化和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。既往研究顯示小鼠腎纖維化組織EMT發(fā)生的同時(shí)GLIPR-2(glioma pathogenesis-related protein2, GLIPR-2)基因高表達(dá)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因在人糖尿病腎病和原發(fā)性肝癌組織中
2、同樣高表達(dá),但其機(jī)制不明。為探討該基因在人腎小管上皮及肝癌細(xì)胞EMT中的作用,我們以高糖條件誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞GLIPR-2的表達(dá)并探討其與該細(xì)胞EMT過程的關(guān)系,以及缺氧條件誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在GLIPR-2作用下的遷移和侵襲能力的變化,以期探明該基因在糖尿病腎病的發(fā)生和原發(fā)性肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制,從而進(jìn)一步豐富對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生及肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)。
方法:
1.針對(duì)GLIPR-2基因的siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成雙鏈寡核苷酸
3、鏈,連接到慢病毒載體pMAGic7.1上;重組pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增,利用凝膠電泳和DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性。
2.慢病毒膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒、重組pMAGic7.1-shRNA質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集慢病毒粗顆粒,濃縮獲得高滴度的純化慢病毒顆粒。
3.慢病毒感染HK-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞株,利用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選表達(dá)綠色熒光蛋白(
4、Green Fluorescent Protein,GFP)的細(xì)胞。
4. HK-2和HepG2細(xì)胞分別在高糖或缺氧下培養(yǎng),利用Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞中GLIPR-2、EMT相關(guān)標(biāo)志物以及相應(yīng)信號(hào)通路的表達(dá)水平;利用Tanswell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力。
5.高糖或缺氧條件下,檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)重組慢病毒質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞GLIPR-2、EMT相關(guān)標(biāo)志物、信號(hào)通路以及細(xì)胞遷移和侵襲能力
5、。
結(jié)果:
1.凝膠電泳和 DNA測(cè)序鑒定結(jié)果證實(shí),設(shè)計(jì)并合成的針對(duì)人 GLIPR-2基因siRNA靶點(diǎn)和陰性對(duì)照 siRNA靶點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸鏈成功連接到了慢病毒載體pMAGic7.1上,并能夠在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。
2. HK-2細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)72 h,與0 h比較,結(jié)果顯示,細(xì)胞GLIPR-2表達(dá)量增加;EMT相關(guān)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin表達(dá)量明顯減少,間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和 Vime
6、ntin表達(dá)量明顯增加;p-ERK1/2表達(dá)量也明顯增加;遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)隨之增加。應(yīng)用ERK1/2抑制劑PD98059,可明顯抑制HK-2細(xì)胞α-SMA和Vimentin的表達(dá),增加 E-caherin的表達(dá);遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)減少。表明高糖誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞GLIPR-2高表達(dá)的同時(shí)也能夠激活p-ERK1/2通路誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生,增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。
3.高糖培養(yǎng)條件下,HK-2細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染后,與對(duì)照慢病毒感染組比較,結(jié)
7、果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中GLIPR-2表達(dá)明顯被抑制;EMT相關(guān)的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯增加,α-SMA和Vimentin表達(dá)量明顯減少;p-ERK1/2表達(dá)量也明顯減少;遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)隨之減少。表明,高糖條件下,干擾HK-2細(xì)胞GLIPR-2表達(dá)可通過抑制p-ERK1/2通路抑制細(xì)胞EMT的發(fā)生,減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
4. HepG2細(xì)胞經(jīng)缺氧培養(yǎng)48 h,與0 h比較,結(jié)果顯示,細(xì)胞GLIPR-2表達(dá)量增加
8、; EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯減少,α-SMA和Vimentin表達(dá)量明顯增加;p-ERK1/2表達(dá)量也明顯增加;遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)隨之增加。應(yīng)用ERK1/2抑制劑PD98059,可明顯抑制HepG2細(xì)胞α-SMA和Vimentin的表達(dá),增加E-caherin的表達(dá);遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)減少。表明缺氧誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞GLIPR-2高表達(dá)的同時(shí)也能夠激活p-ERK1/2通路誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生,增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵
9、襲能力。
5.缺氧培養(yǎng)條件下,HepG2細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染后,與對(duì)照慢病毒感染組比較,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中GLIPR-2表達(dá)明顯被抑制;EMT相關(guān)的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯增加,α-SMA和Vimentin表達(dá)量明顯減少;p-ERK1/2表達(dá)量也明顯減少;遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)隨之減少。表明,缺氧條件下,干擾 HepG2細(xì)胞 GLIPR-2表達(dá)可通過抑制p-ERK1/2通路抑制EMT的發(fā)生,減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
10、
結(jié)論:
1.成功構(gòu)建了人 GLIPR-2基因慢病毒 RNAi載體,并且能夠在 HK-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá),達(dá)到干擾GLIPR-2基因表達(dá)的作用。
2.結(jié)果顯示 GLIPR-2可以激活 p-ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞EMT的發(fā)生,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。
3. GLIPR-2可以激活p-ERK1/2通路調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞EMT的發(fā)生,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及ILK的表達(dá).pdf
- FoxO1對(duì)高糖誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的影響及機(jī)制研究.pdf
- 波動(dòng)性高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf
- 法舒地爾對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化影響.pdf
- 高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)RANTES、TGF-β的影響及霉酚酸干預(yù)研究.pdf
- 缺氧誘導(dǎo)因子1α-腎損傷分子1通路對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的影響.pdf
- siRNA抑制CTGF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大和轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制.pdf
- Sonic Hedgehog信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及白藜蘆醇干預(yù)作用研究.pdf
- 全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞ACE-ACE2表達(dá)的影響.pdf
- PRS-CTGF-siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf
- 川芎嗪對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響.pdf
- BMP-7拮抗缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞株EMT的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 高糖環(huán)境中腎小管上皮細(xì)胞c-met的表達(dá)及意義.pdf
- 腎損傷分子1對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬作用的影響.pdf
- 青蒿琥酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf
- 黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf
- ILK、MMP-9在高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的表達(dá)及意義.pdf
- 高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的作用和機(jī)制研究.pdf
- 高糖對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞差異蛋白組學(xué)研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論