骨橋蛋白與TIP30在口腔鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　 口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3％。其好發(fā)部位為舌、牙齦、頰粘膜等，是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，特別是舌癌呈惡性浸潤性生長(zhǎng)、易轉(zhuǎn)移，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為60-80％。腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者術(shù)后生存率較低的重要原因，為了提高口腔鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，需深入了解口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)

2、移機(jī)制。目前對(duì)腫瘤的研究已廣泛并逐步深入至基因、分子和蛋白水平，但仍需大量研究探討口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，及其對(duì)預(yù)后的影響。深入研究并逐步揭示口腔鱗癌的腫瘤標(biāo)志物和抑癌基因，有利于完善現(xiàn)有的診斷和治療手段，具有重要的臨床意義。
　　 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種富含唾液酸的分泌型磷酸化糖蛋白，骨橋蛋白的合成和分泌可來自多種細(xì)胞和組織，是一種腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白。骨橋蛋白可以加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解并且促進(jìn)腫瘤血管的

3、形成，從而提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)CD44和整合素可做為細(xì)胞粘附分子（CAM）和細(xì)胞因子來介導(dǎo)OPN參與體內(nèi)眾多的生理和病理過程。國內(nèi)外學(xué)者的大量研究證實(shí)OPN可在多種腫瘤組織中高表達(dá)，另有研究表明OPN也參與了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程。OPN在正?？谇火つぶ袔缀醪槐磉_(dá)，而在口腔鱗癌組織中高表達(dá)。在口腔黏膜癌變過程中，OPN mRNA表達(dá)逐漸升高，并且，OPN的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。
　　 TI

4、P30是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲，抑制腫瘤血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，通過以上機(jī)制TIP30可起到抑癌的作用?，F(xiàn)階段的研究表明，TIP30對(duì)G0～G1期細(xì)胞有阻斷作用，從而降低了S期細(xì)胞比例，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖過程停滯不前;TIP30還可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)從而阻斷腫瘤組織血供的構(gòu)建，缺乏血供的腫瘤組織不能有效地浸潤和轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散;此外，TIP30也通過誘導(dǎo)凋亡基因B

5、ad的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所研究證實(shí)TIP30能夠抑制OPN的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)OPN的mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖及其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲。
　　 目前抑癌基因TIP30和骨橋蛋白在口腔鱗癌中的相關(guān)研究較少，尤其是TIP30在口腔鱗癌中的作用尚未完全明確。本課題著重探討OPN和TIP30在口腔鱗癌中的表達(dá)情況，初步探討其相關(guān)性。
　　 研究目的:
　　 探討口腔鱗癌中骨橋蛋白

6、和TIP30的表達(dá)情況，初步探討其相關(guān)性。
　　 研究方法:
　　 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)口腔鱗癌組織中和癌旁組織中(n=18)骨橋蛋白mRNA及TIP30 mRNA表達(dá)情況;采用免疫組織化學(xué)EnVisionTM法檢測(cè)口腔鱗癌組織石蠟標(biāo)本(n=70)和正常口腔黏膜組織石蠟標(biāo)本(n=20)中骨橋蛋白和TIP30的蛋白表達(dá)情況，運(yùn)用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行累計(jì)光密度(IOD)值

7、分析，并采用SPSS17.0軟件分析不同臨床、病理學(xué)特征下口腔鱗癌組織中骨橋蛋白和TIP30的蛋白表達(dá)情況;根據(jù)上述兩部分結(jié)果進(jìn)一步分析其相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、OPN mRNA在口腔鱗癌組織中和癌旁組織中的表達(dá)比較
　　 采用RT-PCR法，得出△CT癌=8.36±2.16，△CT癌旁=9.58±1.94，可見口腔鱗癌組織中的△CT值低，而癌旁組織中的△CT值高，根據(jù)公式△CT=CT目的基因-CT

8、管家基因，△△CT=△CT癌-△CT癌旁，△CT值與基因拷貝數(shù)成反比，即OPNmRNA在口腔鱗癌組織中的表達(dá)要高于癌旁組織中。進(jìn)一步可計(jì)算出OPN在口腔鱗癌組織中mRNA表達(dá)/癌旁組織中mRNA表達(dá)=2-△△CT;18例患者口腔鱗癌組織標(biāo)本中均檢測(cè)到OPN表達(dá)，陽性率為100％。其中，15例標(biāo)本中OPN mRNA在口腔鱗癌組織中與在癌旁組織中T/N倍數(shù)大于2倍，再次表明OPN在口腔鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織中。應(yīng)用SPSS17.0

9、軟件對(duì)口腔鱗癌組織和癌旁組織的△CT值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得出t值=6.828(P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、TIP30 mRNA在口腔鱗癌組織中和癌旁組織中的表達(dá)比較
　　 采用RT-PCR法，得出△CT癌=9.61±1.42，△CT癌旁=8.35±1.65，可見口腔鱗癌組織中的△CT值高，而癌旁組織中的△CT值低，根據(jù)公式△CT=CT目的基因-CT管家基因，△△CT=△CT癌旁-△CT癌，△CT值與基因拷

10、貝數(shù)成反比，即TIP30mRNA在癌旁組織中表達(dá)要高于口腔鱗癌組織中。進(jìn)一步可計(jì)算出TIP30在癌旁組織中mRNA表達(dá)/口腔鱗癌組織中mRNA表達(dá)=2-△△CT，其中TIP30mRNA在14例癌旁組織中與口腔鱗癌組織中N/T倍數(shù)大于2倍，表明TIP30在癌旁組織中表達(dá)明顯高于口腔鱗癌組織中。應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)口腔鱗癌組織和癌旁組織的△CT值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得出t值=10.234(P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

11、3、OPN在口腔鱗癌組織中和正?？谇火つそM織中的蛋白表達(dá)水平比較
　　 采用免疫組織化學(xué)En VisionTM法檢測(cè)口腔鱗癌組織石蠟切片中和正?？谇火つそM織石蠟切片中OPN的表達(dá)情況，OPN在口腔鱗癌組織中和正常口腔粘膜組織中的表達(dá)有差異，OPN在正?？谇火つそM織中幾乎不表達(dá)，而在口腔鱗癌組織中高表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)高倍鏡視野(400倍)，應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像處理軟件分別計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野的O

12、PN的IOD值。得出IOD癌=66096.0±10921.0，IOD正常=46748.0±9513.3，應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)口腔鱗癌組織和正?？谇火つそM織的IOD值進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，得出Z值=5.629(P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)70例口腔鱗癌患者石蠟標(biāo)本根據(jù)臨床分期可分為Ⅰ期（40例），Ⅱ期（12例），Ⅲ～Ⅳ期(18例)，各期的IOD值依次為60695.0±8948.5、68780.0±5825.2、763

13、08.0±9714.8，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，得出P＜0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在不同臨床分期之間OPN的表達(dá)情況有差異，且隨著臨床分期的增加，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)。根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況將70例口腔鱗癌石蠟標(biāo)本分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（12例）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(58例)，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的IOD值為78484.0±8780.2，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組IOD值為63532.0±9514.6，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，得出P＜0.00

14、1，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間OPN的表達(dá)有差異，且OPN在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。同時(shí)還對(duì)70例口腔鱗患者癌石蠟標(biāo)本分別進(jìn)行性別、年齡、病理分級(jí)、原發(fā)部位分組，并依次計(jì)算OPN表達(dá)的IOD值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、TIP30在口腔鱗癌組織中和正?？谇火つそM織中的蛋白表達(dá)水平比較
　　 采用免疫組織化學(xué)En VisionTM法檢測(cè)口腔鱗癌組織石蠟切片中和正常口腔黏膜

15、組織石蠟切片中TIP30的表達(dá)情況，TIP30在口腔鱗癌組織中和正?？谇火つそM織中的表達(dá)有差異，且TIP30在正?？谇火つそM織中高表達(dá)，而在口腔鱗癌組織中相對(duì)低表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)高倍鏡視野(400倍)，應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像處理軟件分別計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野的TIP30的IOD值。得出IOD癌=28566.0±6887.4，IOD正常=47486.0±11625.0，應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)口腔鱗癌組織

16、和正?？谇火つそM織的IOD值進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，得出Z值=5.983(P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)70例口腔鱗癌患者石蠟標(biāo)本根據(jù)臨床分期分為Ⅰ期(40例)，Ⅱ期（12例），Ⅲ～Ⅳ期(18例)，各期的IOD值依次為33036.0±4510.3、25930.0±3896.3、21304.0±5225.4，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，得出P＜0.001，提示在不同的臨床分期之間TIP30表達(dá)有差異，且隨著臨床分

17、期的增加，其表達(dá)逐漸減弱。根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況將70例口腔鱗癌患者石蠟標(biāo)本分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（12例）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（58例），其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的IOD值為19590.0±3368.5，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組IOD值為30423.0±5896.0，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，得出P＜0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間TIP30的表達(dá)有差異，TIP30在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。同時(shí)還對(duì)70例口腔鱗癌患者石蠟標(biāo)

18、本分別進(jìn)行性別、年齡、病理分級(jí)、原發(fā)部位分組，并依次計(jì)算TIP30表達(dá)的IOD值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、18例口腔鱗癌組織標(biāo)本OPN與TIP30相關(guān)性分析
　　 利用RT-PCR所得的OPN與TIP30的mRNA△CT值，采用Spearman秩相關(guān)性分析，得出18例口腔鱗癌組織標(biāo)本中OPN與TIP30的相關(guān)系數(shù)r=-0.246(P=0.040);兩者之間負(fù)相關(guān)性明顯。
　　 6、18例癌旁

19、組織標(biāo)本OPN與TIP30相關(guān)性分析
　　 利用RT-PCR所得的OPN與TIP30的mRNA△CT值，采用Spearman秩相關(guān)性分析，得出18例癌旁組織標(biāo)本中OPN與TIP30的相關(guān)系數(shù)r=-0.477(P=0.034);兩者之間負(fù)相關(guān)性明顯。
　　 7、70例口腔鱗癌石蠟標(biāo)本OPN與TIP30相關(guān)性分析
　　 利用En VisionTM法所得的OPN與TIP30的表達(dá)蛋白IOD值，采用Spearman秩相關(guān)

20、性分析，得出70例口腔鱗癌組織石蠟標(biāo)本中OPN與TIP30的相關(guān)系數(shù)r=-0.255(P=0.033);兩者之間負(fù)相關(guān)性明顯。
　　 8、20例正?？谇火つそM織石蠟標(biāo)本OPN與TIP30相關(guān)性分析
　　 利用En VisionTM法所得的OPN與TIP30的表達(dá)蛋白IOD值，采用Spearman秩相關(guān)性分析，得出20例正常口腔黏膜組織石蠟標(biāo)本中OPN與TIP30的相關(guān)系數(shù)r=-0.489(P=0.029);兩者之間負(fù)相關(guān)

21、性明顯。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 1、在口腔鱗癌中，OPN mRNA呈高表達(dá)，TIP30 mRNA呈低表達(dá)，與癌旁組織對(duì)照具有明顯的差異。這一結(jié)果表明在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中兩者起了完全不同的作用。
　　 2、在口腔鱗癌中，OPN、TIP30蛋白表達(dá)量與mRNA表達(dá)情況一致，且在不同臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有明顯差異。兩者對(duì)口腔鱗癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能有一定的相關(guān)性。
　　 3、用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，通過對(duì)兩種不