TIP30在腦膠質(zhì)瘤中的作用及臨床意義.pdf

1、背景:
　　 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性神經(jīng)上皮細(xì)胞腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50％。綜合發(fā)病年齡高峰在30-40歲之間。目前腦膠質(zhì)瘤的治療主要有手術(shù)、放療、化療、生物靶向治療等手段，但由于腫瘤生長(zhǎng)速度快并呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，以及對(duì)放化療介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不敏感等惡性生物學(xué)特性，總體治療療效不佳，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，所以明確關(guān)鍵的致癌途徑，尋找腦膠質(zhì)瘤新的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。TIP30(Tat-interactive protein30)

2、是一相對(duì)分子質(zhì)量為30KD的轉(zhuǎn)錄共分子，基因定位于人類第11號(hào)染色體，可與人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)轉(zhuǎn)錄輔助因子Tat蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白Tat的轉(zhuǎn)錄活性，從而特異性地提高HIV的增殖。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究均提示TIP30其實(shí)是一種新的抑癌基因，它在人類正常組織如心、腦、肺、腎、胰腺中廣泛表達(dá)，但在乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、涎腺癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)甚至缺失。目前研究發(fā)現(xiàn)TI

3、P30主要是通過(guò)延緩細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的耐受性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性等多種功能起到抑制腫瘤發(fā)展的作用。盡管TIP30在多種惡性腫瘤中的作用逐漸明朗，但目前有關(guān)TIP30與腦膠質(zhì)瘤之間的相關(guān)性報(bào)道仍較少，TIP30在腦膠質(zhì)瘤中是否也充當(dāng)著抑癌基因的角色尚不清楚。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor Recepto

4、r，EGFR)是一種跨膜糖蛋白，分子量170Da，屬于酪氨酸激酶型受體，通過(guò)與EGF等配體結(jié)合后激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路如MAPK/ERK、PI3K/AKT等從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、遷移、侵襲、黏附和細(xì)胞損傷修復(fù)等一系列過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因在人腦惡性膠質(zhì)瘤中常常出現(xiàn)擴(kuò)增、重排、突變和過(guò)度表達(dá)，其下游AKT、ERK等信號(hào)通路蛋白在也存在過(guò)表達(dá)與共表達(dá)，借助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞生長(zhǎng)失控和轉(zhuǎn)化，并且與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。有關(guān)TIP30

5、與EGFR之間的關(guān)系目前也是研究的熱點(diǎn)。肖華等研究發(fā)現(xiàn)在TIP30基因敲除的小鼠中，EGFR下游通路上調(diào)，自發(fā)性肺腫瘤的發(fā)生率增高。進(jìn)一步研究證實(shí)TIP30可與細(xì)胞膜上ACSL4、Endophilin B1等物質(zhì)形成復(fù)合物，影響早期內(nèi)涵體環(huán)節(jié)的EGFR分選，加速EGFR和配體EGF的分離，促進(jìn)EGFR向溶酶體的分選和降解，從而終止EGFR下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的作用。但是目前在腦膠質(zhì)瘤中TIP30與EGFR的相關(guān)關(guān)系尚未清

6、楚，TIP30是否也可以通過(guò)下調(diào)EGFR及其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，需要我們進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究TIP30在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中蛋白表達(dá)情況的差異，及其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系。然后進(jìn)一步在細(xì)胞水平驗(yàn)證TIP30對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲、凋亡等功能的影響。最后探討TIP30與EGFR兩者在腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)關(guān)系。
　　 材料與方法:
　

7、　 1.主要的實(shí)驗(yàn)材料
　　 1.1組織標(biāo)本
　　 收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院2006至2011年腦外科收治的92名腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后石蠟病理組織。其中男性40人，女性52人，中位年齡35歲。所有病人術(shù)前未進(jìn)行放化療，且均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為腦膠質(zhì)瘤。其中星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤42例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤25例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤25例。病理分級(jí)WHOⅠ-Ⅱ級(jí)42例，Ⅲ-Ⅳ級(jí)50例。腫瘤大小≥5cm有47例，＜5cm有45例。另取10例癲癇

8、病人手術(shù)后腦組織作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的同意批準(zhǔn)。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)試劑
　　 兔抗人的TIP30多克隆抗體，兔抗人EGFR單克隆抗體，兔抗人的pAKT和pERK單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，DAB顯色劑，蘇木素，無(wú)水乙醇，95％酒精，1％鹽酸酒精，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒，胎牛血清，high-glu

9、coseDMEM，轉(zhuǎn)染試劑lipo2000，質(zhì)粒提取試劑盒，MTT，Matrigel基底膠，Annexin(Ⅴ)-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒等。
　　 1.3實(shí)驗(yàn)儀器
　　 恒溫孵箱，流式細(xì)胞儀，電泳槽，PCR擴(kuò)增儀，冰箱，光學(xué)顯微鏡，高速離心機(jī)，電子天平秤，載玻片，蓋玻片，培養(yǎng)皿，吸管，微量移液器，試管，EP管，凍存管等。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 選取腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件為10％胎牛

10、血清+高糖的DMEM，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體呈多角形，突起細(xì)長(zhǎng)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)流程
　　 3.1 TIP30和EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)92例腦膠質(zhì)瘤和10例對(duì)照組腦組織石蠟切片中TIP30和EGFR表達(dá)情況的差異。并且分析兩者蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)及血清封閉后，加入TIP30抗體或EGFR抗體，4℃過(guò)夜。次日復(fù)溫45min后PBS沖洗，加入

11、二抗，室溫下孵育1h，顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用半定量雙盲法，即400倍高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。染色結(jié)果分別以顯微鏡下觀察細(xì)胞顯色程度和比例計(jì)分。細(xì)胞顯色程度:無(wú)顯色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分;顯色細(xì)胞比例:＜10％計(jì)0分，10％～30％計(jì)1分，31％～60％計(jì)2分，＞60％計(jì)3分。兩項(xiàng)分值的乘積＞2分者視為T(mén)IP30或EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)。
　　 3.2 TI

12、P30和EGFR蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病人臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系收集92例腦膠質(zhì)瘤病人的臨床資料，按照患者的性別（男、女）、年齡(≥35、＜35歲）、病理類型（星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）、病理分級(jí)（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)、Ⅲ-Ⅳ級(jí)）、腫瘤大小(≥5cm、＜5cm)對(duì)TIP30和EGFR進(jìn)行分層分析。同時(shí)電話隨訪病人的生存情況，進(jìn)行TIP30單因素和多因素生存分析，評(píng)價(jià)TIP30是否是腦膠質(zhì)瘤病人的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。
　　

13、 3.3 TIP30對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)功能的影響采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87過(guò)表達(dá)TIP30，并設(shè)立空載體對(duì)照組和未處理組，免疫印跡及RT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。之后進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)，其中包括MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，評(píng)價(jià)TIP30對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的影響。
　　 3.

14、4 TIP30與EGFR在腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)關(guān)系慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87過(guò)表達(dá)TIP30后，免疫印跡的方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)株中EGFR及其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路中的兩種主要蛋白pAKT和pERK的表達(dá)量是否也隨之改變，初步探討TIP30是否可以影響EGFR及其下游通路來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　 4.數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。TIP30及EGFR在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織之間、兩者與患者臨床病理參數(shù)之間的比較

15、采用Pearsonx2檢驗(yàn);體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示（實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，至少兩次實(shí)驗(yàn)是在同一實(shí)驗(yàn)條件下完成），組間的比較采用Student-t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Sperman相關(guān)分析，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素生存分析采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TIP30和EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)92例腦膠質(zhì)瘤組織中，TIP3

16、0的陽(yáng)性率為54.3％(50/92)，而正常腦組織中的陽(yáng)性率達(dá)90.0％(9/10)，差異具有顯著性(P=0.03)。相反，EGFR在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常腦組織(57.6％ vs20.0％，P=0.04)。Sperman相關(guān)性分析提示TIP30與EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.57，P＜0.01。
　　 2.TIP30和EGFR蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 TIP30

17、蛋白表達(dá)同腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別無(wú)關(guān)，而與病理類型、腫瘤分級(jí)和腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。單因素生存分析提示TIP30陽(yáng)性表達(dá)組總生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于陰性表達(dá)組（26.4 vs20.6個(gè)月，P=0.019）。多因素分析則表明TIP30也是腦膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一(P=0.043)。與此相反，EGFR蛋白表達(dá)則與腦膠質(zhì)瘤患者惡性程度較高的病理類型、分化差的高級(jí)別腫瘤和較大的腫瘤大小相關(guān)(P＜0.05)。EGFR表達(dá)陽(yáng)性的患者的總

18、生存時(shí)間也明顯短于表達(dá)陰性者（21.3 vs27.0個(gè)月，P=0.021）。
　　 3.TIP30抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TIP30后，腫瘤細(xì)胞無(wú)論是生長(zhǎng)增殖速度、遷移速度還是侵襲的速度都較對(duì)照組明顯減慢，但細(xì)胞早期凋亡的數(shù)量過(guò)表達(dá)組卻較對(duì)照組明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.TIP30負(fù)性調(diào)節(jié)EGFR及其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白的表達(dá)

19、慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TIP30后，EGFR蛋白的表達(dá)量較空載體對(duì)照組明顯減少，除此之外，EGFR下游信號(hào)通路蛋白pAKT和pERK的表達(dá)量也隨之下調(diào)，說(shuō)明TIP30可以負(fù)性調(diào)節(jié)EGFR及其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.TIP30在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，它與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)，但與患者病理類型、分級(jí)、腫瘤大小和總生存時(shí)間密切相關(guān)，同時(shí)也是腦膠質(zhì)瘤病人一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。