TIP30基因mRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其5’-UTR區(qū)CpG島甲基化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景與實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 肝細(xì)胞癌是我國(guó)最常見(jiàn)也是死亡率最高的惡性腫瘤之一,每年因患肝癌而死亡的人數(shù)約占全世界肝癌死亡人數(shù)的50﹪;其惡性程度高、進(jìn)展快,且容易發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是限制其療效的關(guān)鍵因素.肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)由多基因控制,受多因素影響,多階段多步驟的復(fù)雜過(guò)程;在這個(gè)過(guò)程中癌基因的激活或抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展最基本的分子基礎(chǔ).尋找腫瘤惡變過(guò)程發(fā)生異常改變的基因,研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,闡明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作

2、用,將有利于我們認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,提高腫瘤的臨床治療率. riP30,是一種30kD的Tat(Transactivator of transcription)結(jié)合蛋白(Tat-Interaefive Promin),又稱HTATIP2(Hβ-1 Tat interactive protein 2),是Xiao H等在研究人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HⅣ)的體外轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)的,其作為

3、HⅣ轉(zhuǎn)錄的輔助因子可以和Tat相互結(jié)合特異性地提高HⅣ增殖.TIP30在人類的多種組織如心、腦、肺、腎、骨骼肌和胰腺中均有表達(dá),但在多種腫瘤組織中表達(dá)下降或缺失.研究表明:一方面,TIP30/CC3是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子,具有絲/蘇氨酸激酶活性可以和RNA聚合酶Ⅱ最大亞基結(jié)合并磷酸化其C-末端的七肽重復(fù)基序,在特定生理病理環(huán)境下調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;另一方面TIP30/CC3能夠以RanGTP非

4、依賴形式直接與Importin β家族成員及核孔蛋白相結(jié)合抑制核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能,通過(guò)抑制核物質(zhì)輸入促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抑癌作用. DNA甲基化是一種基因表觀性修飾,它不改變基因序列但會(huì)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或修飾DNA空間結(jié)構(gòu)從而影響基因表達(dá).DNA甲基化狀態(tài)的改變是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素,是腫瘤抑制基因失活的方式之一,它通過(guò)基因機(jī)制和基因外機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化的相關(guān)基因表達(dá)異常,造成細(xì)胞失去正常過(guò)程的控制而發(fā)生惡變形成腫瘤.近年來(lái),DNA

5、甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到人們的關(guān)注,研究腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化有助于深入理解腫瘤形成機(jī)理,并且可以為腫瘤的早期診斷、病理分型、療效評(píng)估及復(fù)發(fā)檢測(cè)等提供十分重要的信息. TIP30基因是否存在甲基化改變以及甲基化是否影響了它在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道.本課題通過(guò)檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TIP30基因mRNA的表達(dá),揭示該基因與肝癌的關(guān)系,并通過(guò)MSP和BSP方法檢測(cè)基因5'-UTR區(qū)的CpG島甲基化狀態(tài),探索該

6、基因在肝癌細(xì)胞中下調(diào)的原因以及該基因啟動(dòng)子甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用.實(shí)驗(yàn)方法: 1.應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)11P30基因mRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,比較肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系TIP30基因mRNA的表達(dá)差異. 2.采用熒光素酶報(bào)告基因載體PGL-3 Enhancer分析TIP30啟動(dòng)子在HL7702細(xì)胞系中的活性: 3.利用PLOTCpG程序?qū)IP30基因5'-UTR區(qū)的CpG島進(jìn)行了分析

7、,并利用Methyl Primer Express Software 1.0設(shè)計(jì)MSP和BSP引物,建立了檢測(cè)TIP30基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的方法. 4.用MSP和BSP法檢測(cè)了不同肝癌細(xì)胞株TIP30基因5'-UTR區(qū)的甲基化狀態(tài). 5.用甲基化抑制劑處理肝癌細(xì)胞,觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞TIP30表達(dá)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.TIP30基因mRNA在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中都有表達(dá),但不同細(xì)胞間的表達(dá)差異較大 2.TI

8、P30基因mRNA在多數(shù)肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常肝細(xì)胞(p<0.01),但在PLC和XJC肝癌細(xì)胞中其表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞. 3.在HL7702細(xì)胞中,TIP30基因啟動(dòng)子的-135/-45是TIP30的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū),TESS軟件分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在SP1多個(gè)結(jié)合位點(diǎn). 4.PLOTCpG程序分析發(fā)現(xiàn)TIP30基因5'-UTR區(qū)存在兩個(gè)典型的CpG島,一個(gè)跨越轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),一個(gè)跨越翻譯起始位點(diǎn). 5.MS

9、P和BSP結(jié)果顯示在TIP30 mRNA表達(dá)低的肝癌細(xì)胞中部分細(xì)胞該基因5'-UTR區(qū)是甲基化的,部分TIP30表達(dá)低的和TIP30表達(dá)高的肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞都沒(méi)有甲基化現(xiàn)象,說(shuō)明甲基化參與了TIP30基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,是TIP30基因在肝癌中表達(dá)降低的原因之一.6.甲基化抑制劑明顯提高了5'-UTR區(qū)甲基化的肝癌細(xì)胞TIP30 mRNA的表達(dá).實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.首次采用Real-Time PCR方法檢測(cè)了肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中TIP30基

10、因mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞TIP30的表達(dá)存在較大差異,和正常肝細(xì)胞相比多數(shù)肝癌細(xì)胞TIP30mRNA的表達(dá)是降低的,揭示了TIP30和肝癌之間的相關(guān)性.2.首次對(duì)TIP30基因的啟動(dòng)子功能進(jìn)行了研究,并發(fā)現(xiàn)-135/-45是其主要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū),該區(qū)域存在多個(gè)可能的SPl結(jié)合位點(diǎn).3.首次應(yīng)用PLOTCpG程序?qū)IP30基因5'-UTR區(qū)進(jìn)行CpG島分析,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)典型的CpG島,其中第一個(gè)島CpG二核苷酸含量更豐富,更容易被甲基