LHX6基因的甲基化檢測(cè)及其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、惡性腫瘤危害全人類的健康，治療和預(yù)防腫瘤是全球性的課題。腫瘤是一種基因型疾病，近年來，表觀遺傳(epigeneties)突變的研究越來越受到重視，其中DNA甲基化突變是最常見的突變方式。研究表明，CpG島超甲基化異常往往早于細(xì)胞惡性增生，腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)有全基因組低甲基化而局部高甲基化的現(xiàn)象?；虻募谆桓淖兓虻木幋a序列，且該現(xiàn)象可為去甲基化藥物逆轉(zhuǎn)。因此，對(duì)腫瘤甲基化標(biāo)記基因的檢測(cè)可用于腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估，其甲基化位點(diǎn)有潛力成為治

2、療的分子靶點(diǎn)。所以，尋找腫瘤中的甲基化相關(guān)標(biāo)記性基因成為診療新方法發(fā)展的關(guān)鍵，是目前癌癥研究的熱點(diǎn)之一。 LHX6基因位于人染色體上9q33.2位置，全稱是Homo sapiens LIM homeobox 6。其產(chǎn)物屬于LIM蛋白家族，可結(jié)合DNA和蛋白質(zhì)，作為轉(zhuǎn)錄因子存在，在胚胎發(fā)育中起重要作用，與牙齒發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞遷徙、定位和分型有關(guān)。新近研究表明LHX6很可能是一個(gè)頭頸癌相關(guān)基因。但關(guān)于LHX6基因與其他腫瘤的相關(guān)性，以

3、及在腫瘤中的作用仍知之甚少。因此，本文希望在A549肺癌細(xì)胞株、HepG2肝癌細(xì)胞株、MCF-7乳腺癌細(xì)胞株及Hela宮頸癌細(xì)胞株四種腫瘤細(xì)胞中分析LHX6基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討LHX6基因在腫瘤增殖中的作用，為該基因作為診斷靶基因和去甲基化治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。 本文首先對(duì)LHX6全基因序列中的CpG島進(jìn)行分析，并結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)分析對(duì)基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄可能產(chǎn)生影響的甲基化位點(diǎn)。MS-PCR分析該段區(qū)域在A549肺癌細(xì)胞株

4、、HepG2肝癌細(xì)胞株、MCF-7乳腺癌細(xì)胞株及Hela宮頸癌細(xì)胞株四種腫瘤細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)。用5-Aza-CdR對(duì)四種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理。由于5-Aza-CdR的去甲基化作用存劑量依賴性，所以首先尋找有效處理濃度。對(duì)藥物處理前后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察形態(tài)變化和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率的改變。繼而用RT-PCR檢測(cè)藥物處理前后四種腫瘤細(xì)胞中LHX6基因表達(dá)的改變；MS-PCR檢測(cè)藥物處理前后LHX6基因在腫瘤細(xì)胞中的甲基化水平。

5、 結(jié)果顯示LHX6基因啟動(dòng)子區(qū)附近存在CpG島，該段區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變可能會(huì)影響基因的表達(dá)。MS-PCR發(fā)現(xiàn)LHX6基因在四種腫瘤細(xì)胞中存在不同程度的甲基化，其中A549細(xì)胞中存在較其他二種腫瘤細(xì)胞高的甲基化狀態(tài)(甲基化特異PCR條帶光密度值占甲基化和非甲基化條帶廣密度總值的71.4％，而其他三種腫瘤細(xì)胞中只占55％左右)。在5-Aza-CdR處理濃度梯度實(shí)驗(yàn)中尋找到終濃度為1×10-6mol/L的5-Aza-CdR，可使細(xì)胞

6、增殖率最大程度降低，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。MTT法檢測(cè)到藥物處理組A549細(xì)胞增殖率相對(duì)于對(duì)照組OD值降低72.2％。顯微鏡觀察藥物處理組和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)四種腫瘤細(xì)胞的形態(tài)均有改變，其中對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的影響最明顯，細(xì)胞形態(tài)明顯不規(guī)則，可觀察到部分細(xì)胞破碎、死亡．RT-PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR處理后，LHX6基因在A549細(xì)胞中恢復(fù)表達(dá)，而其他三種腫瘤細(xì)胞的對(duì)照組和藥物處理組中均無表達(dá)。該現(xiàn)象與MTT法檢測(cè)到的A549