基于近紅外熒光的甲基化及其基因表達檢測新技術(shù)的研究.pdf

1、表觀遺傳學是研究不涉及DNA序列改變的基因表達和調(diào)控的可遺傳變化，其中，甲基化是最常見的DNA表觀遺傳修飾。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。因此，甲基化與癌癥、衰老、老年癡呆等眾多疾病密切相關(guān)。為了研究DNA甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，必須精確地檢測基因組中的DNA甲基化。目前，檢測DNA甲基化的方法各種各樣，但絕大多數(shù)程序較為繁瑣，且不能將甲基化檢測結(jié)果與基因

2、表達調(diào)控效應聯(lián)系起來，難以用于基因表達的表觀遺傳調(diào)控機制的研究。因此，建立一種簡單而高效的可同步檢測DNA甲基化及其基因表達調(diào)控效應的新技術(shù)非常必要。研究表明多種基因啟動子區(qū)相關(guān)CpG島的高甲基化所導致的表觀遺傳學沉默通常與疾病相關(guān)?；诖四康?，結(jié)合我們實驗室多年研究的雙鏈DNA微陣列(dsDNA microarray)技術(shù)，我們建立了一種可同步檢測基因甲基化，特別是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(TFBS) DNA甲基化及其基因表達調(diào)控效應的新方法

3、。同時，本課題對該技術(shù)進行擴展，選取不同的固相載體材料分別從甲基化和基因表達檢測等方面入手進行新技術(shù)的創(chuàng)新。
　　本論文取得的主要結(jié)果如下:
　　1.尼龍膜是一種合成的長鏈聚酰胺薄膜，對核酸和蛋白質(zhì)具有很強的結(jié)合能力，近紅外熒光(NIRF)具有高靈敏度，高信噪(S/N)比等特點?；谝陨蟽煞N優(yōu)點，本研究建立了一種基于膜的近紅外熒光法(M-NIFA)檢測DNA甲基化及其基因表達調(diào)控。該方法基于雙鏈DNA微陣列(dsDNA mi

4、croarray)技術(shù)包含兩個檢測系統(tǒng)，即甲基化和轉(zhuǎn)錄本檢測系統(tǒng)。前者通過使用抗5-甲基-胞嘧啶抗體（5-MC抗體）檢測DNA甲基化，后者則通過生物素化的cDNA檢測基因的轉(zhuǎn)錄本。5MC-抗體和生物素的信號可以被近紅外熒光標記的第二抗體和鏈霉親和素所報告，兩個檢測系統(tǒng)的可行性，可通過人工合成的修飾有甲基和生物素的寡核苷酸得以驗證。本文最后選取結(jié)腸癌細胞（LOVO細胞）中已知的高甲基化基因p14ARF進行甲基化和轉(zhuǎn)錄本的檢測，檢測結(jié)果表明

5、該方法的可靠性。該研究提供了一種新方法可以同時檢測DNA甲基化及基因表達調(diào)控，另外該方法免亞硫酸氫鹽處理和PCR擴增，具有寬動態(tài)范圍和較高靈敏度。新技術(shù)的建立有助于更好的探索DNA甲基化及基因表達調(diào)控效應。
　　2.DNA甲基化檢測過程中尼龍膜材料可以進行多基因單樣品的檢測，但是修飾有特殊基團（如活性NOS基團）的微孔板則可以更為靈活的同時進行多基因多樣品的檢測。因此，我們建立了一種新型的甲基化檢測技術(shù)-微孔型近紅外熒光法(W-N

6、IFA)檢測DNA甲基化。該方法實現(xiàn)甲基化檢測主要包含兩個步驟，即偶聯(lián)捕獲探針的微孔板捕獲超聲波打斷的基因組DNA片段，以及隨后的免疫學過程結(jié)合近紅外熒光成像技術(shù)。該研究中，我們通過人工合成的寡核苷酸進行新方法的可行性探索，通過對不同癌癥細胞系的三類基因KIR3DL1（K562，慢性髓原白血病細胞），p14ARF(LOVO，結(jié)腸癌細胞）和TP53BP2（HepG2，肝癌細胞）啟動子區(qū)共9個基因位點的甲基化檢測，驗證了該方法的可靠性。

7、r>　　3.微孔板、近紅外熒光結(jié)合雙鏈DNA微陣列技術(shù)，不僅可以檢測啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，還可以對基因表達調(diào)控效應進行探索，即mRNA分子豐度的檢測。近紅外熒光的高靈敏度，微孔板的靈活性以及雙鏈DNA微陣列技術(shù)的精確性使該方法的建立成為可能。本研究中，我們建立了一個基于近紅外熒光-基因表達檢測（NIRF-GED）的新技術(shù)。NIRF-GED的檢測過程主要包含三個步驟，即生物素標記的cDNA的制備，微孔板雜交和NIRF標記-鏈霉親和素的近紅

8、外熒光成像。本研究以轉(zhuǎn)錄因子NF-κB靶基因Ccl20、Cxcl2以及持家基因GAPDH為研究對象，利用寡核苷酸探針建立NIRF-GED技術(shù)的檢測標準曲線，通過將HeLa細胞的總cDNA以濃度梯度與3種基因的固定探針雜交，根據(jù)標準曲線求得這3種基因的cDNA分子數(shù)，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)驗證NIRF-GED結(jié)果。結(jié)果表明NIRF-GED可以較為準確地檢測這些基因在被檢測細胞中的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果還表明，NIRF-GED可以用來實現(xiàn)基因表達

9、的絕對定量分析。因此，本研究提供了一種基因表達檢測的新方法。
　　4.修飾有特殊基團的醛基玻片是一種重要的微陣列芯片。通過DNA微陣列形式在醛基玻片上排列多個捕獲探針，可以實現(xiàn)更高通量的檢測。本研究中，通過進行近紅外-醛基玻片(S-NIFA)系統(tǒng)的建立及優(yōu)化、利用MeDIP和E2F-ChIP技術(shù)分別富集甲基化DNA片段以及目的蛋白結(jié)合的DNA片段，我們進行了S-NIFA技術(shù)在甲基化及其對轉(zhuǎn)錄因子與TFBS互作研究方面的探索;結(jié)合基

10、因表達的熒光定量PCR技術(shù)，本文探討了DNA甲基化、基因表達及其對轉(zhuǎn)錄因子與TFBS互作的影響。本研究采用的醛基玻片有以下兩個優(yōu)點:第一，實驗材料的消耗，包括寡核苷酸的氨基修飾、初級抗體和熒光標記的第二抗體將大大下降，使得這種方法的性價比更高。第二，各個基因位點間的實驗均一性和相容性將通過在非常小的區(qū)域內(nèi)檢測多個目標位點得到改善。該方法如果在原有基礎(chǔ)上繼續(xù)改進，有望在其它核酸分子如病原微生物等的高靈敏性檢測方面發(fā)揮重要作用。
　　

11、5.胚胎發(fā)育是基因選擇性地按一定時空順序表達的過程。胚胎發(fā)育過程中，表觀遺傳對維持哺乳動物正常生命活動起著不可替代的作用。為進一步探討甲基化及其對基因表達調(diào)控效應的影響，我們對人胚胎肺細胞（HFL-Ⅰ細胞）的兩個重要E2F靶基因TP53BP2及Apaf-1的CpG島啟動子區(qū)進行了生物信息學預測，分析甲基化易發(fā)區(qū)域及其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點間的關(guān)系。在生物信息學預測的基礎(chǔ)上，我們針對目標靶區(qū)域進行了亞硫酸氫鹽測序，通過甲基化抑制劑處理細胞結(jié)合

12、熒光定量PCR反應，我們考察了啟動子區(qū)甲基化分布及其對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、靶基因表達調(diào)控效應的影響。結(jié)果表明兩個基因啟動子區(qū)均存在一定程度的甲基化，并且生物信息學預測的甲基化CpG與亞硫酸氫鹽測序測得的甲基化CpG部分重合，亞硫酸氫鹽測序?qū)嶒灉y得的CpG甲基化還出現(xiàn)在某些重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，提示兩個基因的表達調(diào)控可能在一定程度上受到甲基化尤其是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點甲基化的影響;通過甲基化抑制劑5-氮雜脫氧胞苷處理細胞后，我們發(fā)現(xiàn)兩個基因的基因

13、表達均有不同程度的上調(diào)，進一步說明在胚胎發(fā)育早期TP53BP2和Apaf-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在一定程度上受到甲基化的影響?？傊狙芯拷Y(jié)果對進一步了解表觀遺傳調(diào)控及其對胚胎發(fā)育過程的影響提供幫助。
　　本研究建立的新技術(shù)在甲基化檢測方面無需亞硫酸氫鹽處理、免疫沉淀、PCR擴增等繁瑣的程序，同時可以實現(xiàn)對甲基化多基因、多位點、正負鏈的高通量檢測;在基因表達檢測方面，與常規(guī)方法相比具有免PCR擴增、靈敏度較高等特點。這些新方法豐富了DN