2A肽介導的三熒光蛋白基因共表達系統(tǒng)在轉基因羊中的表達及其DNA甲基化初步研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟和科學研究的發(fā)展,多基因共表達技術在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用越來越重要。目前,常用的多基因共表達方法有內(nèi)核糖體進入位點(IRES)元件載體、雙向或雙啟動子共表達、多個質粒共轉染及多病毒載體共感染等。但是這些方法都遇到了多基因共表達不平衡及表達量不足的問題,如IRES下游基因的表達對其在IRES之后的特異定位敏感,有可能造成表達沉默,或下游蛋白的表達水平遠低于同一開放閱讀框中上游蛋白的表達水平。2A肽則能夠改善以上缺陷。2A

2、肽屬于cis-水解酶作用元件(CHYSELs),多基因載體在2A肽調控下各基因可獨立表達。與IRES相比,2A肽序列短(54-90bp)、能夠調節(jié)多基因獨立表達且表達效率高,具有其它多基因共表達技術無可比擬的優(yōu)點。
　　目前,大多數(shù)轉基因動物的制備均以單基因表達為目標,而多基因共表達制備轉基因動物的研究較少。利用2A肽生產(chǎn)多基因修飾動物已在小鼠和豬上報道,但在綿羊上未見報道。慢病毒載體轉基因技術是目前家畜生產(chǎn)中效率最高的轉基因技術

3、,2A肽介導的多基因共表達與慢病毒載體相結合制備轉基因動物,具有轉基因效率高、多基因同時表達的特點。在一個轉基因動物上同時表達多個功能基因,能夠通過轉基因實現(xiàn)多個基因協(xié)同作用或多基因聚合作用,提高轉基因動物的利用效率,減少轉基因動物生產(chǎn)成本,縮短轉基因動物的生產(chǎn)周期。本研究中,我們選用三色熒光蛋白報告基因(tdTomato、zsYellow1和acGFP1)作為2A肽連接的靶基因,以便于2A肽介導的多基因在細胞和動物體內(nèi)表達的觀察和檢測

4、。首先,將報告基因tdTomato、zsYellow1和acGFP1與2A肽連接,克隆構建了三基因共表達慢病毒載體(pLEX-2A-TYG);將pLEX-2A-TYG重組慢病毒感染CHO和293T細胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察三色熒光蛋白的表達;在此基礎上利用慢病毒卵周隙注射方法進行綿羊轉基因,首次獲得了攜帶三色熒光的轉基因綿羊,通過PCR、Westernblotting、Southernblotting、RealTimeRT-PCR等

5、方法對轉基因整合、多基因表達及DNA甲基化等進行了分析;針對轉基因羊出現(xiàn)的基因表達沉默現(xiàn)象,通過DNA甲基化序列分析(BisulfitesequencingPCR,BSP),檢測了轉基因羊外源基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)的甲基化水平,利用甲基轉移酶抑制劑(5-azaC)和乙酰化酶抑制劑(TSA)分別處理分離的轉基因羊成纖維細胞,對多基因共表達轉基因羊的DNA甲基化機制進行了探索。本研究主要研究結果如下:
　　1設計并合成了長為102bp的

6、2A-linker片段。經(jīng)PCR、酶切、克隆,成功構建了由2A-linker連接的三色熒光蛋白基因(tdT.omato、zsY.ellow1和acG.FP1)共表達慢病毒載體(pLEX-2A-TYG)。
　　2利用該重組載體pLEX-2A-TYG轉染293T和CHO細胞,熒光顯微鏡觀察和Westernblotting檢測結果表明,tdTomato、zsYellow1和acGFP1能夠在細胞中獨立、高效表達。
　　3運用脂質體

7、轉染法制備重組慢病毒,將pLEX-2A-TYG質粒與包膜質粒pMD2.G和包裝質粒pSPAX2共轉染293T細胞,獲得了高滴度(3×109IU/ml)重組慢病毒顆粒。將生產(chǎn)的重組慢病毒感染293T和CHO細胞,Confocal熒光顯微鏡檢測結果顯示,2A肽介導的三熒光蛋白基因可以在感染細胞中獨立高效表達。
　　4為了檢測2A肽介導的三色熒光蛋白報告基因載體是否可以在動物體內(nèi)表達,我們利用慢病毒卵周隙注射技術生產(chǎn)轉基因綿羊。選取供體

8、羊5只,受體羊37只。利用重組慢病毒卵周隙注射獲得可移植轉基因胚胎37枚,移植入37只受體母羊中。出生羔羊7只,其中2只(＃6和＃7)經(jīng)PCR檢測為陽性轉基因羊。
　　5在紫外燈下觀察轉基因羔羊耳部、頭部、唇部、蹄部等部位,均沒有觀測到熒光。以轉基因羔羊尾部皮膚組織為樣本,對轉基因羊中三色熒光蛋白基因的表達進行Westernblotting及RT-PCR檢測,均未檢測到三種熒光蛋白。
　　6為了分析造成轉基因表達沉默的原因,

9、我們利用BSP法對轉基因羊尾組織基因組進行了甲基化分析。結果顯示,轉基因啟動子區(qū)甲基化水平為76.25％(＃6)和64.70%(＃7);編碼區(qū)甲基化水平在＃6轉基因羊中tdTomato、zsYellow1和acGFP1分別為97.5%、98.1%、和99.2%;＃7羊中tdTomato、zsYellow1和acGFP1分別為97.6%、99.5%和99.6%。結果表明,轉基因羊外源基因存在超甲基化現(xiàn)象。我們推測,轉基因超甲基化導致了熒光

10、蛋白基因在轉基因羊中的表達沉默。
　　7為了證明DNA超甲基化是否為轉基因表達沉默的原因,我們利用DNA甲基轉移酶抑制劑(5-azaC)和去乙酰化酶抑制劑(TSA)對分離的轉基因羊成纖維細胞進行處理。首先采取2只陽性(＃6和＃7)和1只陰性羔羊的尾部皮膚,分離培養(yǎng)了成纖維細胞,用5-azaC和TSA按不同濃度、不同作用時間,分別或同時對分離的轉基因羊成纖維細胞進行處理。經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細胞術分析,結果顯示,經(jīng)5-azaC和T

11、SA分別處理后,部分成纖維細胞可見三色熒光的表達,且熒光細胞比例隨著藥物處理濃度及時間的增加而增加,兩者呈一定的正相關。同時,當5-azaC和TSA共同作用時,熒光細胞數(shù)顯著高于5-azaC或TSA單獨作用時的熒光細胞數(shù),表明5-azaC與TSA存在協(xié)同作用。以上結果表明,細胞中熒光蛋白報告基因的表達與DNA甲基化和組蛋白去乙酰化存在明顯關聯(lián);5-azaC與TSA共同作用時存在協(xié)同作用。
　　綜上所述,我們利用2A肽介導的多基因共

12、表達慢病毒載體成功制備了三色熒光蛋白轉基因羊,為未來多基因共表達轉基因研究提供了新材料。在研究中,我們發(fā)現(xiàn)2A肽介導的多基因共表達慢病毒載體在體外真核細胞中能夠獨立高效表達,但在轉基因羊中表達沉默。轉基因羊成纖維細胞經(jīng)5-azaC和TSA處理后,部分細胞熒光蛋白報告基因的表達被激活,提示我們DNA甲基化在轉基因動物中對轉基因的表達調控發(fā)揮著至關重要的作用。研究轉基因表達調控機制,降低轉基因DNA超甲基化水平,規(guī)避轉基因表達沉默,是本實驗