金屬硫蛋白-3在食管癌中的表達(dá)及其CpG島超甲基化研究.pdf

1、目的：食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤。中國(guó)男、女平均死亡率分別為7.7/10萬(wàn)和18.8/10萬(wàn)<'[1]>，嚴(yán)重危害著人們的健康。流行病學(xué)資料顯示膳食缺乏維生素、亞硝酸鹽含量增高以及食物霉菌污染等可能與食管癌發(fā)生有關(guān)<'[2，3，4]>。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)食管癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多個(gè)基因的改變，是癌基因的激活與抑癌基因失活長(zhǎng)期協(xié)同作用的結(jié)果。因此深入研究食管癌的發(fā)病機(jī)制，以有效地對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和治療有著非常重要的意義。如同其它惡性腫瘤

2、，食管癌的發(fā)生和發(fā)展包括遺傳機(jī)制和后生機(jī)制，而甲基化是目前已知的唯一后生機(jī)<'[5]>。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類(lèi)廣泛分布于生物體體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，在維持金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、重金屬的解毒、清除自由基等方面具有重要作用。至今已發(fā)現(xiàn)MT的四種同分異構(gòu)體，即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。相對(duì)于其他金屬硫蛋白，MT-3具有特異結(jié)構(gòu)和特異生物學(xué)功能，是神經(jīng)系統(tǒng)中第一個(gè)被鑒定的具有神經(jīng)元生長(zhǎng)抑

3、制功能的蛋白質(zhì)<'[6]>。有研究顯示胃癌中MT-3基因存在異常甲基化<'[26]>。本課題應(yīng)用MethvlatedSpecific PCR(MSP)法和Reverse Transcription PCR(RT-PCR)法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株、新鮮食管癌標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)正常食管粘膜組織中MT-3基因CpG島的甲基化情況及MT-3的表達(dá)情況，旨在研究MT-3基因CpG島超甲基化與食管癌之間的關(guān)系。材料與 方法： 1 選取四種食管癌細(xì)

4、胞株：OE33、Eca109、TEl和TEl3，根據(jù)結(jié)果選擇一種食管癌細(xì)胞株作為陽(yáng)性對(duì)照；采集胃癌手術(shù)中近側(cè)端正常食管粘膜(均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)、)5例做為陰性對(duì)照；采集手術(shù)切除的食管癌組織及對(duì)應(yīng)的正常食管粘膜組織各20例。 2 分別提取上述細(xì)胞株和組織的DNA和RNA，DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理后，應(yīng)用MSP法對(duì)MT-3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況進(jìn)行研究；應(yīng)用RT-PCR法對(duì)MT-3 mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究，然后與患者臨床病理參

5、數(shù)進(jìn)行比較。 結(jié)果： 1 四種食管癌細(xì)胞株MT-3基因CpG島均存在超甲基化，細(xì)胞株0E33發(fā)生甲基化，細(xì)胞株Eca109、TEl和TEl3為半甲基化。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示：MT-3 mRNA在細(xì)胞株OE33中無(wú)表達(dá)，在細(xì)胞株Eca109、TEl和TEl3中均有弱表達(dá)。故選擇細(xì)胞株OE33做為陽(yáng)性對(duì)照。 2 65％食管癌組織(13/20)和25％正常食管粘膜組織(5/20)存在MT-3基因CpG島超甲基化，而5例

6、正常食管粘膜均未發(fā)生超甲基化(0/5)，提示MT-3基因超甲基化與食管癌發(fā)生之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X<'2>=6.465，P=0.011)。 3 40％食管癌組織(8/20)和65％正常食管粘膜組織(13/20)存在MT-3基因表達(dá)，而5例正常食管粘膜組織均有表達(dá)，提示MT-3 mRNA表達(dá)與食管癌之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X<'2>=2.506，P=0.113)。 4 MT-3 mRNA表達(dá)率在甲基化腫瘤組織與非甲基化腫瘤組織

7、分別為23.1％和71.4％，甲基化腫瘤組織中MT-3 mRNA表達(dá)率低于非甲基化腫瘤組織，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X<'2>=4.432，P=0.035)；MT-3 mRNA表達(dá)率在甲基化正常食管粘膜組織與非甲基化正常食管粘膜組織分別為20％和80％，正常食管粘膜組織中MT-3 mRNA表達(dá)率甲基化組低于非甲基化組，二者比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X<'2>=5.934，P=0.015)。 5 根據(jù)術(shù)后病理資料，食管癌組織中呈高/中度組

8、織分化者M(jìn)T-3基因甲基化率為46.2％(6/13)，低分化者甲基化率為100％(7/7)，二者比較有相關(guān)性(X<'2>=5.799，P=0.016)。分化程度越低，甲基化的比率越高；甲基化與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒和腫瘤的分期均無(wú)關(guān)。 結(jié)論： 1 食管癌組織中MT-3基因CpG島甲基化率明顯高正常食管粘膜組織。 2 食管癌組織中MT-3基因CpG島甲基化明顯抑制了該基因的表達(dá)。 3 食管癌中MT