人FⅧ基因的表達不依賴其5′端CpG島的甲基化.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定的重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-sequencing PCR,BSP）檢測平臺，檢測人類永生化肝細胞LO2中凝血因子Ⅷ（Coagulation factorⅧ,FⅧ）基因5′端CpG島的甲基化水平，對比檢測正常人新鮮肝組織及L-Arg刺激的LO2細胞FⅧ甲基化CpG島的狀態(tài)，探究甲基化的CpG島對FⅧ表達的調(diào)控作用。
　　方法：Methprimer軟件預(yù)測FⅧ基因啟動子上游的CpG島，將第一個CpG島劃分為三個

2、獨立片段：CpG is1-1、CpG is1-2及CpG is1-3；第二個CpG島為一個完整片段：CpG is2。并設(shè)計BSP引物。運用BSP聯(lián)合TA克隆、藍白斑篩選及質(zhì)粒PCR，驗證十個陽性單克隆并送測序，BiQ Analyzer軟件對測序結(jié)果進行甲基化位點分析，以（甲基化CG位點個數(shù)）/（甲基化CG位點個數(shù)+非甲基化位點個數(shù)）計算各個CpG位點的甲基化率。RT-PCR檢測LO2細胞、正常人肝組織及L-Arg刺激的LO2細胞FⅧ的轉(zhuǎn)

3、錄水平，BSP檢測正常人肝細胞及L-Arg刺激的LO2細胞CpG is2的甲基化狀態(tài)，SPSS軟件分析三者之間CpG is2的單個CpG位點甲基化率的差異。
　　結(jié)果：人FⅧ基因5′端存在兩個CpG島：CpG island1位于-4879─-4071，全長809bp；CpG island2位于-3600─-3323，全長278bp。LO2細胞中，CpG is1-1共12個CpG位點，整體甲基化率為0％；CpG is1-2共40個C

4、pG位點，整體甲基化率為0-20%；CpG is1-3共27個CpG位點，整體甲基化率為0-20%；CpG is2共23個CpG位點，整體甲基化率為80-100%。RT-PCR結(jié)果顯示：LO2細胞不轉(zhuǎn)錄FⅧ；正常人肝細胞及L-Arg刺激LO2細胞36小時后能檢測到FⅧ的轉(zhuǎn)錄。對比檢測CpG is2甲基化水平，正常人肝組織為70%-100%，L-Arg刺激LO2細胞為60%-100%。LO2細胞、正常人肝組織及L-Arg刺激的LO2細胞C