胃癌中腫瘤相關(guān)基因啟動子CpG島甲基化及TGFβ-Smad信號傳導系統(tǒng)表達的初步研究.pdf

1、第一部分實驗目的：胃癌在世界范圍內(nèi)是發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一。目前胃癌發(fā)生機制的研究主要集中于分子和細胞生物學水平，包括抑癌基因在內(nèi)的相關(guān)基因的失活在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用?；虻氖Щ罘绞接泻芏啵渲?，啟動子CpG島的異常甲基化受到越來越多的重視。最近的研究證實啟動子CpG島甲基化可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中都發(fā)揮重要作用，并且是導致抑癌基因失活的重要機制。本實驗通過檢測10個腫瘤相關(guān)基因啟動子CpG島甲基化在94例胃

2、癌癌組織和癌旁組織中的發(fā)生率，探討上述基因的甲基化與性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細胞分化程度及PTNM臨床分期的關(guān)系，建立胃癌較為完整的相關(guān)基因甲基化譜，為臨床早期診斷胃癌提供理論依據(jù)。 實驗方法：應用酚／氯仿法按常規(guī)抽提組織的基因組DNA，經(jīng)過亞硫酸鹽處理，應用甲基化特異的PCR(methylation-specificPCR，MSP)方法檢測94例胃癌癌組織、癌旁組織胃粘膜10個基因的甲基化發(fā)生率。將部分PCR產(chǎn)物回收

3、，應用腺病毒載體構(gòu)建重組體導入大腸桿菌中，培養(yǎng)后挑選克隆測序，同時測定甲基轉(zhuǎn)移酶(SssImethylase)處理癌旁正常組織DNA后甲基化狀態(tài)。 實驗結(jié)果：我們共檢測了E-cad、DAPK、APC、p16INK4a、RASSFla、hMLHl、TGFBRI、TGFBRII、COX-2和MGMT等10個基因的甲基化發(fā)生情況，我們發(fā)現(xiàn)E-cad、APC和RASSFla這三個基因在胃癌組織中發(fā)生了甲基化而在癌旁正常組織中無甲基化發(fā)生

4、，分別是E-cad為3496(32／94)，APC為2396(22／94)，RASSFla為57％(54／94)。DAPK、hMLHl、TGFBRII和p16INK4a這4個基因胃癌組織甲基化率高于相應癌旁組織，分別是DAPK為59％(55／94)和3％(3／94)，hMLHl為28％(26／94)和5％(5／94)，TGFBRII為43％(41／94)和3％(3／94)，p16INK4a為45％(42／94)和23％(22／94)，均

5、達到統(tǒng)計學意義(p<0．01)。相反的是COX-2基因，胃癌組織和相應癌旁組織都有去甲基化和甲基化條帶，胃癌組織甲基化率低于相應癌旁組織，并且差異達到統(tǒng)計學意義(p

6、RASSFla為53％(3l／59)和66％(23／35)，hMLHl為31％(t8／59)和23％(8／35)，TGFβRI為12％(7／59)和11％(4／35)，TGFβRII為39％(23／59)與51％(18／35)，MGMT為15％(9／59)和17％(6／35)。9個基因基因男女甲基化率均無統(tǒng)計學差異。 94例胃癌按年齡≤65歲和>65歲分為兩組，甲基化率分別是E-cad為35％(22／63)與32％(10／31)

7、，DAPK為52％(33／63)與71％(22／31)，APC為27％(17／63)與16％(5／31)，p16INK4a為32％(20／63)與71％(22／31)，RASSFla為49％(31／63)與74％(23／31)，hMLHl為24％(15／63)與35％(11／31)，TGFβRI為14％(9／63)與7％(2／31)。TGFβRII為43％(27／63)與45％(14／31)，MGMT為19％(12／63)與10％(3／

8、3D。其中p16INK4a和RASSFla的甲基化率>65歲組高于≤65歲組，p

9、INK4a為58％(7／12)、42％(11／26)與43％(24／56)，RASSFla為67％(8／12)、65％(17／26)與52％(29／56)，hMLHl為33％(4／12)、27％(7／26)與27％(15／56)，TGFβRI為17％(2／12)、15％(4／26)與9％(5／56)，TGFβRII為50％(6／12)、46％(12／26)與41％(23／56)，MGMT為17％(2／12)、15％(4／26)與16％(

10、9／56)。三組9個基因的甲基化率差異無統(tǒng)計學意義。 94例胃癌根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可分為兩組，其甲基化率分別是E-cad為35％(9／26)與34％(23／68)，DAPK為46％(12／26)與55％(43／68)，APC為23％(6／26)與24％(16／68)，p16INK4a為46％(12／26)與44％(30／68)，RASSFla為46％(12／26)與62％(42／68)，hMLHl為23％(6／26)與29％(2

11、0／68)，TGFβR工為12％(3／26)與12％(8／68)。TGFβRIl35％(9／26)與47％(32／68)，MGMT為15％(4／26)與16％(1l／68)。未發(fā)現(xiàn)有基因與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。 94例胃癌按腫瘤細胞分化程度分為好、中等、差三組，其甲基化率分別是E—cad為27％(12／45)、39％(14／36)與46％(6／13)，DAPK為40％(18／45)、70％(25／36)與92％(12／13)，A

12、PC為29％(13／45)、17％(6／36)與23％(3／13)，p16INK4a為40％(18／45)、56％(20／36)與31％(4／13)，RASSFla為53％(24／45)、50％(18／36)與92％(12／13)，hMLHl為22％(10/45)、39％(14／36)與15％(2／13)，TGFβRI為13％(6/45)、11％(4／36)與8％(1／13)，TGFβRIl27％(12／45)、50％(18／36)與8

13、5％(11／13)，MGMT為18％(8／45)、11％(4／36)與23％(3／13)。大多數(shù)基因都表現(xiàn)為隨著腫瘤細胞分化越差其甲基化率越高，而且我們可以看出DAPK、TGFBRII和RASSFla的甲基化率與細胞分化程度明顯相關(guān)，P

14、DAPK為33％(5／15)、23％(5／22)、69％(25／36)與95％(20／21)，APC為13％(2／15)、36％(8／22)、19％(7／36)與24％(5／21)，p16INK4a為33％(5／15)、59％(13／22)、39％(14／36)與48％(10／2D，RASSFla為40％(6／15)、41％(9／22)、64％(23／36)與76％(16／21)。hMLHl為27％(4／15)、32％(7／22)、28

15、％(10／36)與24％(5／2D，'rOFBRI為7％(1／15)、9％(2／22)、1l％(4／36)與19％(4／21)，TGFBRIl27％(4／15)、27％(6／22)、42％(15／36)與76％(16／21)，MGMT為7％(1／15)、18％(4／22)、17％(6／36)與19％(4／21)。九個基因中DAPK、RASSFla和TGFβRII胃癌的PTNM分期相關(guān)，隨著分期的增加甲基化率隨著升高，其中DAPK和TGF

16、βRII的差異明顯，P

17、I和COX-2等8個基因在胃癌中發(fā)生甲基化或者去甲基化(COX-2)，并且甲基化的水平與腫瘤細胞的分化程度、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和PTMN分期密切相關(guān)。 第二部分目的：研究TGF-βRI、TGF-BRII和Smad4蛋白在胃癌中的表達，初步了解其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。 方法：對本院34例胃癌患者，應用免疫組化方法分析癌組織中TGF-βRI、TGF-βRII和Smad4蛋白的表達情況，表達丟失率之間采用X。檢驗。