熒光定量PCR聯(lián)合檢測急性白血病患者ERG和MN1基因的表達及其臨床意義.pdf

1、急性白血?。ˋL）是我國的十大惡性腫瘤之一，也是青少年發(fā)病率最高的惡性腫瘤。AL包括急性淋巴細胞白血病（ALL）和急性髓細胞白血?。ˋML）。AL的發(fā)生是由于骨髓中異常的白血病細胞大量的增殖并不斷侵犯機體各個器官、組織，使得正常造血功能受到抑制，從而引起臨床常見的感染、出血、貧血等癥狀[2]。AL一旦發(fā)生，病情危重，進展迅猛，死亡率高。近年來由于環(huán)境污染等因素，AL的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。隨著新的化療藥物的應(yīng)用、化療方案的改進、支持治療

2、的加強及造血干細胞移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用，AL的治療效果已有明顯改善，75%左右的AML患者經(jīng)化療后可獲完全緩解（CR），但仍有20%～30%AL病人經(jīng)常規(guī)化療方案不能獲得CR，稱為難治性AL。此外，50%左右的CR病人還會出現(xiàn)復(fù)發(fā)。而一旦出現(xiàn)難治和復(fù)發(fā)，再次緩解率低，預(yù)后差。因此，難治和復(fù)發(fā)是目前導(dǎo)致AL治療失敗的最根本原因。 目前所制定難治復(fù)發(fā)白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)均為臨床治療后的回顧性診斷，無法運用于指導(dǎo)臨床分層治療。如果能夠建立起

3、一套難治復(fù)發(fā)白血病早期診斷的方法，不僅可以早期預(yù)測難治復(fù)發(fā)，判斷病人的預(yù)后；而且更重要的是能夠指導(dǎo)臨床治療，對高危病人應(yīng)改變常規(guī)的治療模式，采用更積極的個體化治療，如更早地選擇異基因造血干細胞移植等，從而減少難治復(fù)發(fā)白血病發(fā)生率、提高AL治療緩解率和長期生存率，具有十分重要的意義。 目前研究發(fā)現(xiàn)某些基因的異常與白血病發(fā)生及發(fā)展（難治復(fù)發(fā)）存在密切關(guān)系，如AML的FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（FLT3/ITD）突變和ALL的bcr/abl

4、融合基因的表達。目前已證實20%～30%AML和ALL病人分別存在FLT3/ITD突變和bcr/abl融合基因的表達，而具有FLT3/ITD突變AML和bcr/abl陽性ALL易出現(xiàn)難治復(fù)發(fā)，預(yù)后差，可作為早期診斷難治復(fù)發(fā)的分子指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。但70%～80%AML和ALL不存在FLT3/ITD突變和bcr/abl融合基因，且目前尚缺乏同時在ALL和AML均有異常表達并與預(yù)后相關(guān)的基因異常。因此，尋找新的與難治復(fù)發(fā)AL相關(guān)的基因異常

5、用于指導(dǎo)臨床分層治療顯得十分迫切。最新研究提示ERG基因及MN1基因在AL患者中過度表達，且可能與難治復(fù)發(fā)AL相關(guān)。 ERG基因[V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog（avian）]位于21q22，是ETS癌基因家族的一員，ETS轉(zhuǎn)錄因子是系特異性的調(diào)節(jié)淋巴細胞定型、分化的關(guān)鍵分子，而ERG在調(diào)節(jié)淋巴細胞早期成熟過程中起重要作用。在早期T、B淋巴細胞和髓系細胞中都可

6、檢測到ERG特異性的表達。研究發(fā)現(xiàn)ERG過度表達常見于有復(fù)雜核型和21染色體異常的AML患者中，ERG基因在造血干細胞，原始巨核細胞系，唐氏綜合癥患者的白血病細胞內(nèi)也可出現(xiàn)表達。ERG基因在細胞的增殖、分化和凋亡過程中起關(guān)鍵作用，目前發(fā)現(xiàn)ERG基因可以在AML與ALL患者均可出現(xiàn)異常表達并可能與預(yù)后相關(guān)。 MN1基因[meningioma（disrupted in balanced translocation）1]起初被發(fā)現(xiàn)是

7、腦膜瘤患者t（4；22）的一個靶基因，盡管MN1與腦膜瘤之間的關(guān)系仍然未明，但是它被認為是22染色體上主要的腦膜瘤腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)MN1可在原始造血細胞及ALL患者中出現(xiàn)異常高表達，提示MN1在白血病形成過程中起重要作用。文獻報道MN1是造血過程中獨立的致癌基因，可能通過促進增殖及抑制分化而誘發(fā)白血病。目前發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AML及ALL患者均可以發(fā)現(xiàn)MN1基因的異常表達，但不同AL患者中其表達水平存在較大差異。國外最新研究發(fā)現(xiàn)，MN1的

8、過度表達是AML獨立的預(yù)后因素。MN1高表達者其誘導(dǎo)緩解療程第15天對化療的反應(yīng)顯著差于低表達組，且其無復(fù)發(fā)生存率（RFS）和總生存時間（OS）也明顯縮短。 目前發(fā)現(xiàn)MN1和ERG基因的表達水平與AL的預(yù)后存在一定關(guān)系，且考慮到兩者在AL發(fā)生、發(fā)展中的作用及其在不同AL患者中的表達水平的差異。有必要深入研究MN1和ERG基因在AL（包括ALL和AML）患者中的表達水平、明確兩者的相關(guān)性及其與臨床療效和預(yù)后的關(guān)系，探討聯(lián)合定量檢測

9、MN1和ERG基因的表達水平在早期診斷難治AL及預(yù)后判斷中的價值。在本研究中，我們構(gòu)建了實時熒光定量PCR檢測ERG和MN1基因mRNA表達量的方法，并檢測87例初發(fā)AML患者、80例初發(fā)ALL患者及16例非惡性血液病者ERG和MN1 mRNA的表達水平，并對其與細胞形態(tài)學(xué)，細胞遺傳學(xué)，免疫表型、臨床特征、臨床療效及預(yù)后的關(guān)系進行了分析。 目的： 1.構(gòu)建實時熒光定量PCR檢測ERG和MN1基因的方法； 2.檢測

10、初治AL患者（包括AML和ALL）中ERG和MN1基因的表達水平及不同F(xiàn)AB亞型患者中兩基因表達水平的差異。 3.探討AL不同染色體核型、臨床特征及免疫表型與ERG和MN1 mRNA表達水平的關(guān)系； 4.分析ERG基因和MN1基因兩者表達水平之間的關(guān)系及其與AL療效和預(yù)后的關(guān)系。 方法： 1.培養(yǎng)KASUMI-1細胞，提取總RNA，選用GAPDH為內(nèi)參基因，針對ERG、MN1及GAPDH mRNA設(shè)計引物

11、，RT-PCR擴增目標(biāo)片斷，PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化到T載體，構(gòu)建含目標(biāo)片段的質(zhì)粒，做為陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的克隆。 2.克隆的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板按106，105，104，103，102，101copies/μl梯度稀釋，在熒光定量PCR儀分別進行PCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線并驗證該方法的靈敏性和重復(fù)性，同時驗證ERG、MN1、GAPDH三者擴增效率是否一致。 3.研究對象：經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及流式細胞術(shù)免疫學(xué)分型確診的87例

12、初治AML患者及80例初治ALL患者。16名非惡性血液疾病患者骨髓標(biāo)本為試驗對照組，其中特發(fā)性血小板紫癜患者9名，缺鐵性貧血患者7名。 4.提取AL及對照組患者骨髓標(biāo)本，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時熒光定量PCR檢測。每份標(biāo)本均進行3個重復(fù)檢測，最后CT值取其均數(shù)。為排除RNA濃度對擴增效率的影響，ERG和MN1 mRNA表達水平采用的相對表達量來表示，即采用2-△CT值（△CT=ERG/MN1-GAPDH；2-△CT

13、=2GAPDH-ERG/MN1）來表示ERG和MN1的相對表達量，并分析ERG和MN1表達水平與FAB分型、核型、免疫表型、臨床特征、療效和預(yù)后關(guān)系。 5.利用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。兩組計量資料間分布比較用Mann-whitney U test；兩組以上計量資料間分布比較用Kruskal-wallis test及Bonferroni test；兩變量間相關(guān)分析采用Spearman rank correlation t

14、est；率的比較采用卡方檢驗；生存分析采用Kaplan Meier analyses，不同生存曲線間差異采用log-rank test。生存時間的單因素和多因素分析使用Cox Regression。所有檢驗以P<0.05為顯著統(tǒng)計學(xué)差異，雙側(cè)檢驗。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了熒光定量PCR檢測ERG和MN1 mRNA表達水平的方法。 2.AML患者ERG和MN1基因表達水平顯著高于非惡性血液病患者，AML中ERG基因

15、表達水平與MN1基因表達水平未存在相關(guān)性。ALL患者ERG基因表達水平顯著高于對照組，而ALL患者MN1基因表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3.AML患者ERG基因的表達水平與WBC及血清LDH水平存在正相關(guān)，高危染色體核型患者中ERG的表達水平顯著高于低中危組；AML患者ERG基因的表達水平與FAB亞型及CD34、CD56、CD117抗原是否表達無相關(guān)性。AML患者MN1基因表達水平與FAB亞型、血象、臨床特征、免疫表

16、型及染色體危險度分層之間均無相關(guān)性。ALL中ERG基因表達的水平與血象、LDH水平、BCR/ABL及是否伴髓系抗原表達均無相關(guān)性。 4.AML中ERG基因高表達組一年復(fù)發(fā)率顯著高于低表達組、一年OS顯著縮短，是AML預(yù)后不良的指標(biāo)，但ERG基因表達水平對初治AML患者CR率無顯著影響。本實驗顯示MN1基因表達水平對AML的CR率、一年復(fù)發(fā)率及OS無顯著影響。ALL中ERG基因高表達組一年OS顯著縮短，但與CR率及一年復(fù)發(fā)率無顯著