熒光定量PCR檢測急性髓細胞白血病FLT3基因表達及其臨床意義.pdf

1、研究背景： 急性白血病是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病。骨髓中異常的白血病細胞大量增殖并侵潤各種器官、組織，正常造血受抑制。 急性髓細胞白血病(AML)具有高度異質性。因此，需要對AML生物學特征更好的理解，分子特征更好的界定，病理發(fā)病機制更好的闡明，從而更好的區(qū)分AML的亞群，探索包括靶向治療在內的新的治療措施，才能使療效得到進一步改善。 AML中的一些特定染色體異常，如t(15,17)，t(8,21)，in

2、v(16)/t(16；16)，t(11q23)，del(5q)，-7，3q等的發(fā)生率及意義已經明確。目前AML亞群最有意義的分類就是根據(jù)白血病細胞的這些核型異常確定其危險度。由此所確立的三個細胞遺傳學分組(高危組，中危組，低危組)被廣泛接受并用于臨床。但這種分型也有其局限性，它將無特定染色體異常患者全部歸入中危組，而此組病人占所有AML50％左右，包含不同臨床特征和預后，只有進一步對這部分病人進行精細分群，才有可能制定分層治療，以進一步

3、提高療效。因此，有必要深入研究正常核型AML預后相關的基因異常。 FLT3基因主要表達于造血干細胞以及腦、胎盤和肝臟，在骨髓中限制性表達于CD34+細胞。在骨髓中，由基質細胞產生的FLT3配體(FL)以膜結合型和可溶型的方式，和FLT3相互作用，單獨或聯(lián)合其他細胞因子，刺激造血干細胞。這種FLT3及FL的相互作用，在造血干細胞的自我更新、增殖、分化方面起到關鍵性作用。 約20％～25％AML病例存在FLT3基因近膜區(qū)序列

4、內部串連重復(internaltandemduplications，ITD)，稱為FLT3/ITD突變。此外，還有約7％的AML病例存在酪氨酸激酶結構區(qū)點突變，通常發(fā)生在835或836密碼子，稱為FLT3/TKD突變。大部分研究認為FLT3/TKD突變與AML預后無關，而FLT3/ITD突變與AML發(fā)病和發(fā)展密切相關，是一個重要的獨立預后因素。幾項大規(guī)模的研究證實，F(xiàn)LT/ITD突變對AML的影響主要體現(xiàn)在長期預后上，大多數(shù)研究報道，F(xiàn)

5、LT3/ITD突變意味著更短的總生存期(overallsurvival，OS)、無病生存期(disease-freesurvival，DFS)、無事件存活期(event-freesurvival，EFS)和更高的累計復發(fā)率(Cumulativerelapserate，CRR)。并且FLT3/ITD突變后其酪氨酶激酶活性增強，可導致自發(fā)激活，引起RAS和STAT5信號轉導途徑激活，是促進白血病細胞增殖及AML的進展的主要原因之一?，F(xiàn)已有F

6、LT3抑制劑投入Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗，其單用或聯(lián)合化療治療FLT3/ITD突變AML已經取得了肯定的臨床療效。 FLT3基因突變已得到廣泛深入的研究，但與此對應的是關于FLT3基因表達水平與急性白血病的關系還知之甚少。考慮到野生型FLT3在正常骨髓中調節(jié)分化和凋亡的作用，以及在白血病患者中的異常的高表達率，因此有必要深入研究其與AML發(fā)生、發(fā)展及預后關系。在本研究中，我們構建了實時熒光定量PCR檢測FLT3mRNA表達量的方法，并檢

7、測69例初發(fā)AML患者及5例健康者FLT3轉錄子的表達量，對其與FLT3/ITD突變，細胞形態(tài)學，細胞遺傳學，免疫表型、臨床特征及預后的關系進行了探討。 目的： 1、構建實時熒光定量PCR檢測FLT3mRNA表達量的方法。 2、檢測初治AML患者FLT3mRNA表達水平及不同F(xiàn)AB分型表達水平的差異。 3、探討AML不同核型、臨床特征及CD34表達與FLT3mRNA表達量的關系，同時檢測上述AML患者中F

8、LT3/ITD突變情況并分析其與FLT3mRNA表達量的關系。 4、探討FLT3基因表達水平對AML預后的影響及作為檢測微小殘留病變指標的初步評價。 方法： 1.培養(yǎng)THP-1細胞，提取總RNA，針對FLT3mRNA設計引物，RT-PCR擴增目標片斷，PCR產物純化后轉化到T載體，構建含目標片段的質粒，做為陽性定量標準模板的克隆。 2.克隆的陽性定量標準模板按106，105，104，103，102,101

9、copies/μ1梯度稀釋，在熒光定量PCR儀進行PCR反應，得到標準曲線并驗證該方法的靈敏性和重復性。 3.研究對象：AML樣本取自經細胞形態(tài)學、組織化學染色及流式細胞術免疫學分型確診的69例初治AML患者，骨髓異常增生綜合癥(MDS)及繼發(fā)性AML均不作為入選對象。5名健康者骨髓標本為試驗對照組。 4.提取AML及健康者骨髓標本總RNA，逆轉錄為cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，結果參照標準曲線，得到FLT3mRN

10、A表達量，并分析其與FAB分型、核型、CD34表達、臨床特征及療效和預后關系。追蹤部分病例，觀察不同病程中FLT3表達量的變化。 5.提取AML及健康者骨髓標本總DNA，針對FLT3基因在11號外顯子近端和12例號外顯子遠端分別設計保守序列引物，進行PCR擴增，檢測FLT3/ITD突變。 6.兩組計量資料間分布比較用Mann-WhitneyUtest；兩組以上計量資料間分布比較用Kruskal-Wallistest及Bo

11、nferronitest；兩變量間相關分析采用Spearmanrankcorrelationtest；率的比較采用卡方檢驗；生存分析采用KaplanMeieranalyses，不同生存曲線間差異采用log-ranktest。所有檢驗以P＜0.05為顯著統(tǒng)計學差異。 結果： 1.利用Trizol提取的THP-1總RNA經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見28S和18S明顯的2條條帶，證明抽提的RNA質量完好，無DNA污染。R

12、T-PCR擴增后終產物經2％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下觀察，可看到與目的片段大小一致的約70bp的電泳條帶。PCR產物轉化后的陽性重組質粒測序結果與Genebank中相應的堿基序列相比較同源性為100％。 2.不同梯度定量模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)(CT值)之間，有著非常好的線性相關關系(r=0.9996)。靈敏度達10-5μg總RNA。 3.69例AML骨髓標本中FLT3基因表達量中位數(shù)為17240copies/μgRNA(

13、273～834805)，5例健康者骨髓標本中基因表達量中位數(shù)為2648copies/μgRNA(2349～3941)，AML組FLT3基因表達顯著高于正常骨髓組(p=0.017Mann-WhitneyUtest)。各FAB分型間FLT3基因表達量存在顯著差異(P=0.0005，Kruskal-Wallistest)，M2、M4、M5較M3顯著增高。AML中FLT3基因表達的水平與外周血白細胞計數(shù)(WBC)存在相關性(Spearman's

14、相關系數(shù)rs=0.494，P=0.0001)，F(xiàn)LT3基因表達量的增高與WBC數(shù)目成正相關。FLT3表達量與Hb、PLT無明顯相關性。在染色體可評估的57例AML中，F(xiàn)LT3基因在各核型之間的表達存在顯著差異，伴有t(15；17)者低于t(11q23)及復雜核型者，高危核型組高于低危核型組。在有免疫表型結果的65例AML中，流式檢測骨髓白血病細胞CD34陰性及陽性病例之間FLT3基因表達無顯著性差異。 4.69例AML患者FLT

15、3/ITD突變陽性17例(24.6％)。5例健康者FLT3/ITD突變檢測均為陰性。FLT3/ITD突變陰性組及陽性組FLT3基因表達水平無顯著性差異(P=0.205)。 5.49例可隨訪AML中患者中FLT3基因高表達病例化療后CR率與低表達病例CR率相比無顯著性差異(P=0.425)；而在正常核型AML病例中，F(xiàn)LT3基因高表達病例顯示出了CR率低于低表達病例的趨勢(P=0.062)。在誘導治療后中位數(shù)為124天(67～21

16、0天)的隨訪期內，F(xiàn)LT3基因高表達病例與低表達病例的累計復發(fā)率(CRR)無顯著性差異(P=0.631)；但在在正常核型組中，F(xiàn)LT3基因高表達病例的CRR有高于低表達病例的明顯趨勢(P=0.102)。此外，生存曲線圖顯示出正常核型病例中FLT3基因高表達者有OS不利的趨勢。 6.5例患者在疾病進程的不同時間點動態(tài)監(jiān)測FLT3的表達量顯示：3例長期緩解病例在取得CR后FLT3基因表達量進行性降低，在緩解期始終處于一個較低水平，而

17、兩例復發(fā)FLT3基因均表現(xiàn)出在疾病初發(fā)時高表達，CR后水平降低，復發(fā)時又升高的現(xiàn)象。 結論： 1.成功構建了實時熒光定量PCR檢測FLT3mRNA表達水平的方法。 2.AML患者FLT3基因表達水平在AML中顯著高于正常人群，與外周血白細胞計數(shù)存在正相關；在AML各FAB分型及不同染色體核型中存在差異；M2、M4、M5型FLT3基因表達水平顯著高于M3型；預后良好核型其表達量較低，而在預后差核型患者中表達量顯著升