急性髓系白血病患者FLT3與NPM1基因突變檢測及其臨床意義.pdf

1、本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增Fms樣酪氨酸激酶-3(fms-like tyrosine kinase3,FLT3)基因外顯子14-15和核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin family,member1,NPMI)基因外顯子11。通過瓊脂糖凝膠電泳、變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(Denaturingpolyaerylamide gel electrophoresis,Denaturing PAGE)與毛細(xì)管電泳(Capillaryelect

2、rophoresis,CE)3種方法對99例初診急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者FLT3基因中小片段插入突變(length mutation,FLT3-LM)進(jìn)行檢測；并用變性PAGE和毛細(xì)管電泳兩種方法對上述患者NPM1基因插入突變進(jìn)行檢測；同時(shí)我們還應(yīng)用PCR-變性PAGE法對44例骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndromes,MDS)患者的FLT3-LM和NPM1插

3、入突變進(jìn)行檢測。采用G顯帶方法分析了72例AML患者和39例MDS患者的染色體核型。本研究目的是確定FLT3-LM與NPM1突變在初診AML患者中的發(fā)生率、在FAB各亞型患者中的分布、與AML患者染色體核型以及臨床療效之間的關(guān)系；通過對部分FLT3或NPM1基因插入突變陽性患者的PCR產(chǎn)物的直接測序,確定該兩種基因突變的特點(diǎn)；建立一種檢測FLT3-LM與NPM1插入突變靈敏可靠的方法。
　　 結(jié)果:
　　 1.在AML與

4、MDS患者中均可檢出大量染色體核型異常,AMI患者中染色體核型異常率68.06％(49/72)高于MDS患者染色體核型異常率46.15％(18/39)(p<0.05)。
　　 2.AML患者FLT3-LM發(fā)生率為30.3％(30/99)。各種電泳技術(shù)檢測的效率略有不同:瓊脂糖凝膠電泳、變性PAGE、毛細(xì)管電泳3種方法的檢出率分別為20.2％(20/99),29.29％(29/99),30.3％(30/99)。對照組中MDS患者應(yīng)

5、用變性PAGE方法的檢出率為4.55％(2144),正常人中未檢出。
　　 3.AML患者NPM1基因插入突變發(fā)生率為15.15％(15/99)。變性PAGE、毛細(xì)管電泳兩種方法的檢出率分別為11.11％(11/99)和15.15％(15/99),同時(shí)檢測出2例內(nèi)含子缺失突變。對照組中MDS患者與正常人應(yīng)用變性PAGE方法均未檢出突變。
　　 4.30例FLT3-LM+的AML患者中26例患者突變型與野生型等位基因比值(

6、allelicratios,AR)大于0.02,4例患者AR小于0.02。FLT3-LM+M6型患者中,AR均小于0.05。30例FLT3-LM+患者中28例患者(93.33％)突變條帶為1條,2例患者(6.67％)突變條帶多于1條。插入突變序列長度3～144bp不等,不同亞型的插入片段有差別。
　　 5.13例FLT3-LM+患者直接測序結(jié)果顯示,4例插入堿基序列為FLT3野生型片段的完全重復(fù),2例為完全陌生的堿基插入,7例為

7、部分堿基序列重復(fù)。所有重復(fù)或插入序列發(fā)生在p.E573位至P.P606位之間,多集中于p.F590-p.R595之間。
　　 6.10例NPM1基因插入突變陽性患者PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果顯示,10例均為A型突變(c.860863dupTCTG)。突變導(dǎo)致NPM蛋白羧基末端讀碼框移,末尾7個(gè)氨基酸WQWRKSL被11個(gè)氨基酸CLAVEEVSLRK所代替。2例缺失突變直接測序結(jié)果顯示,1例為IVS10-18_-15delCTTT,另

8、外1例IVS10-17_-15delTTr。該2例患者為新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子缺失突變。12例患者中有4例存在3’UTR區(qū)缺失1個(gè)堿基T(*165delT,rs34351976)的多態(tài)性改變。
　　 7.49例核型異常AML患者中FLT3-LM發(fā)生率為24.49％(12/49),23例核型正常AML患者中FLT3-LM為43.48％(10/23)(p>0.05):49例核型異常AML患者中NPM1突變?yōu)?.08％(2/49),23例核型

9、正常AML患者中NPM1突變?yōu)?6.09％(6/23)(p<0.05)。
　　 8.99例AML患者中79例有治療記錄,6例早期死亡(生存期小于14天),可供療效評價(jià)的患者為73例。FLT3-LM+患者中完全緩解(CR)率為36.36％(8/22),低于FLT3-LM-患者CR率62.75％(32/51)(p<0.05)。早期死亡6例患者中FLT3-LM+占50％(3/6)。73例可評價(jià)療效患者中,CR患者中FLT3-LM+占2

10、0％(8/40)、部分緩解(PR)患者中為38.1％(8/21)、未緩解(NR)患者中為50％(6/12)。49例非M3型患者中FLT3-LM+17例,FLT3-LM-32例,達(dá)到CR的患者共17例,其中FLT3-LM-患者CR率為43.75％(13/32),FLT3-LM+患者CR率17.65％(4/17)(p>0.05)。
　　 9.15例NPM1陽性患者中FLT3-LM發(fā)生率為40％(6/15),高于NPM1陰性患者FLT

11、3-LM發(fā)生率28.57％(24/84),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 10.FLT3-LM-/NPM1+患者的CR率為80％(4/5),FLT3-LM-/NPM1+患者的CR率為60.87％(28/46),FLT3-LM+/NPM1-患者的CR率為41.18％(7/17),FLT3-LM+/NPM1+患者CR率為20％(1/5)。非M3亞型AML患者的治療結(jié)果為:FLT3-LM-/NPM1+患者CR率為80％(4/5

12、),FLT3-LM-/NPM1-患者CR率為37.04％(10/27),FLT3-LM+/NPM1-患者CR率為16.67％(2/12),FLT3-LM+/NPM1+患者CR率為20％(1/5)。
　　 11.在17例FLT3-LM+患者的63份標(biāo)本中,復(fù)查時(shí)仍有11例患者為陽性(共20份標(biāo)本)。出現(xiàn)的陽性條帶均與初診時(shí)陽性條帶大小相同。
　　 結(jié)論:
　　 1.AML與MDS患者中存在大量染色體核型異常,對診斷

13、預(yù)后具有重要意義。
　　 2.在FLT3-LM基因突變檢測中,相對于瓊脂糖凝膠電泳,變性PAGE和毛細(xì)管電泳具有較高的分辨率和靈敏度。
　　 3.FLT3-LM與NPM1突變?yōu)锳ML患者中常見基因改變。NPM1突變與FLT3-LM無相關(guān)性。
　　 4.FLT3插入基因序列突變長度范圍變動(dòng)較大,部分導(dǎo)致插入點(diǎn)的氨基酸發(fā)生取代,其他為整框插入；突變型/野生型AR范圍波動(dòng)較大。
　　 5.部分FLT3-LM+患

14、者插入序列為陌生堿基,FLT3基因突變位置相對較集中,所有重復(fù)或插入發(fā)生在p.E573位至p.P606位之間,多集中于p.F590-p.R595之間。
　　 6.AML患者中正常核型患者FLT3-LM發(fā)生率與異常核型患者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,正常核型患者NPM1基因突變發(fā)生率高于異常核型患者。
　　 7.NPM1插入突變均為A型突變,突變導(dǎo)致NPM蛋白羧基末端讀碼框移,末尾7個(gè)氨基酸WQWRKSL被11個(gè)氨基酸CLAVEEVSI