正常核型急性髓系白血病患者NPM突變的檢測及臨床意義.pdf

1、研究表明，大多數(shù)急性髓系白血?。ˋML）患者初診時骨髓原始細(xì)胞至少隱藏著一種染色體變異。其中一些染色體變異，不僅是AML亞型的診斷標(biāo)志，而且還是關(guān)于完全緩解率（CR）、復(fù)發(fā)風(fēng)險及總生存率（OS）的預(yù)后指標(biāo)。然而，相當(dāng)一部分AML患者（約40％-49％的成人和25％的兒童），通過傳統(tǒng)的染色體分析沒有發(fā)現(xiàn)可見的染色體異常。這部分正常核型AML（CN-AML）患者，是AML中占比例最多的亞型，通常歸為預(yù)后中等組。這部分病人的預(yù)后有很大異質(zhì)性，

2、其5年生存率在不同的報告中自24％至42％不等，原因在于他們雖然沒有可見的染色體異常，但基因水平可能存在不同的異常。
　　 人nucleophosmin（NPM）基因定位于5q35，全長約23kb，含12個外顯子。NPM主要定位在核仁顆粒區(qū)，也可通過核定位信號在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間往返，參與核質(zhì)間運輸。國外研究發(fā)現(xiàn)NPM基因第12外顯子突變是AML發(fā)生頻率最高的一種分子遺傳學(xué)改變，可出現(xiàn)在AML各亞型（M3除外）中，主要累及染色體

3、核型正常的患者，發(fā)生率最高可達(dá)64％，并與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NPM基因第12外顯子的插入突變導(dǎo)致C-末端氨基酸殘基改變，使核定位信號丟失，NPM蛋白由核仁區(qū)異常移位至胞質(zhì)區(qū)。
　　 由于常規(guī)檢測NPM突變的方法需PCR擴增與DNA測序先后進(jìn)行，繁瑣費時，為此我們參考國外報道，建立了一種簡便易行的檢測方法，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測胞質(zhì)異常定位的突變NPM蛋白，并用PCR產(chǎn)物測序方法，驗證免疫細(xì)胞化學(xué)法的檢測結(jié)果，對我院62例

4、CN-AML患者NPM突變情況進(jìn)行了初步研究。進(jìn)一步結(jié)合臨床資料分析其意義，初步探討其與CN-AML的關(guān)系。
　　 對象與方法
　　 1.62例原發(fā)初診AML患者來自2006年10月至2009年3月我院收治病例，經(jīng)MIC分型確診，另設(shè)正常對照組7例，來源于我院移植病房正常供者骨髓，染色體至少分析20個克隆為正常核型。
　　 2.病人及正常對照者骨髓細(xì)胞涂片標(biāo)本應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測NPM基因突變導(dǎo)致NPM蛋白

5、胞質(zhì)異常定位情況。骨髓細(xì)胞涂片采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法（S-P）檢測，反應(yīng)應(yīng)用1：50的NPM多克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG二抗，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染固定封片。
　　 3.抽取患者及正常對照組肝素抗凝骨髓液2ml，F(xiàn)icoll分離單個核細(xì)胞，常規(guī)酚-氯仿-異戊醇法提取DNA?；蚪MDNA進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收，直接測序檢測突變情況。
　　 NPM基因第12外顯子擴增引物：上游引物：5'-CAAG

6、ACTATTTGCCATTCCTAAC-3'，下游引物5'-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3'，擴增產(chǎn)物為560bp。反應(yīng)設(shè)立內(nèi)參照β-actin：上游引物：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，擴增產(chǎn)物為268bp。
　　 PCR反應(yīng)體系50μl：包括Taq酶2.5μl，20μM上下游引物各1μl，dNTP100nmol，10×

7、PCRBuffer5μl，基因組DNA1μg，補水至50μl反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃10min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。
　　 結(jié)果
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)法：62例原發(fā)初診正常核型AML患者中共檢出胞質(zhì)定位的NPM蛋白18例（29.0％），7例健康對照者均未發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)NPM蛋白。
　　 2.基因組DNAPCR產(chǎn)物測序法：檢出相應(yīng)的18例患者發(fā)生突變，15例患者為

8、A型突變，3例患者為B型突變。兩種檢測方法結(jié)果完全一致。
　　 3.NPM突變與臨床特征的關(guān)系（見表一）：NPM突變組與未突變組相比，患者發(fā)病時的白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白量、血小板計數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例及淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大、牙齦增生、皮膚浸潤差別無顯著性（P>0.05）；突變組患者的年齡集中于40～60歲；性別以女性為多，男女比例1：1.6。
　　 4.NPM突變與臨床療效的關(guān)系：經(jīng)兩周期標(biāo)準(zhǔn)DA或HA方案誘導(dǎo)緩解，18例N