新型變應(yīng)原疫苗功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、變應(yīng)性鼻炎(Allergy rhinitis，AR)主要是由過敏原誘導(dǎo)、IgE介導(dǎo)的一系列炎癥介質(zhì)釋放而引發(fā)的I型超敏反應(yīng)，主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、反復(fù)打噴嚏、流鼻涕、鼻塞等。目前，變應(yīng)性鼻炎的治療方法有：避免接觸變應(yīng)原、藥物治療和免疫治療等3類，其中免疫治療是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用的唯一對(duì)因治療手段，目前研究較多的免疫治療疫苗主要有基因重組變應(yīng)原疫苗和DNA變應(yīng)原疫苗等。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?本試驗(yàn)所用的藥物主要成分是經(jīng)過

2、基因重組而構(gòu)建的一類低過敏原性過敏原(Hypoallergen)，它將一類泛過敏原與白介素IL-10偶聯(lián)在一起，形成一種新型治療性免疫疫苗LTT，本研究主要目的是建立變應(yīng)性鼻炎的豚鼠模型，探討新型變應(yīng)原疫苗的治療效果。 方法： 1．實(shí)驗(yàn)治療藥物L(fēng)TT為一基因重組蛋白，主要成份為泛過敏原和改良的IL-10，用于實(shí)驗(yàn)前，提取純化為LTT蛋白。 2．蛋白功能的快速鑒定：建立大鼠燙傷模型，用LTT蛋白、PBS和燙傷 1

3、號(hào)、燙傷2號(hào)治療，初步觀察LTT蛋白功能。 3．建立豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型并用LTT蛋白治療 3．1 動(dòng)物分組：70只健康豚鼠隨機(jī)分為五組：模型對(duì)照組、模型組、假治療組(治療對(duì)照組，用PBS治療)、低劑量治療組(LTT低劑量治療，濃度320 mg/L)、高劑量治療組(LTT高劑量治療，濃度1600 mg/L)，每組14只。 3．2 建模：基礎(chǔ)致敏：每只豚鼠以卵清蛋白(OVA)10μg作為致敏原，氫氧化鋁1 mg作為佐

4、劑，用生理鹽水制備1 ml混懸液【10μg OVA+1mg Al(OH)<,3>+生理鹽水→1ml】，腹腔注射行基礎(chǔ)致敏，1次/4 d，共4次；強(qiáng)化致敏：最后一次基礎(chǔ)致敏間歇1周后，每只豚鼠每側(cè)鼻腔局部滴2.5％的OVA共10μL，隔日1次，共5次；激發(fā)：每只豚鼠每側(cè)鼻腔局部滴3％的OVA共20μL，隔日1次，激發(fā)維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。模型對(duì)照組均以生理鹽水代替卵白蛋白OVA。模型組及模型對(duì)照組于激發(fā)兩周后處死，以便在癥狀之外進(jìn)行病理學(xué)鑒定，

5、來判斷變應(yīng)性鼻炎模型是否成功。3．3．用藥試驗(yàn)：建立變應(yīng)性鼻炎模型后，治療組則于第4次激發(fā)后開始用藥治療，每次激發(fā)后鼻腔滴LTT藥物10μL，治療組兩種濃度用藥處理均為1次/d，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每處理中高、低劑量組的藥物濃度分別為1600 mg/L(即50 mmol/L)和320mg/L(即10 mmol/L)。空白對(duì)照組則以PBS代替LTT。用藥20天后處死所有豚鼠。 4．實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)： 燙傷創(chuàng)面觀察：大鼠背部局部燙傷，

6、每天用不同藥物治療后觀察創(chuàng)面愈合程度。 癥狀觀察：模型組和模型對(duì)照組于每次激發(fā)后30分鐘內(nèi)觀察各實(shí)驗(yàn)組豚鼠抓鼻及打噴嚏癥狀并計(jì)數(shù)。各治療組于每次用藥治療后30min內(nèi)觀察癥狀。 標(biāo)本采集及病理觀察：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，乙醚吸入麻醉，斷頭處死豚鼠，分離鼻背，取出鼻中隔粘膜，放入10％中性甲醛固定，蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察鼻腔粘膜病理形態(tài)改變。 5．結(jié)果統(tǒng)計(jì)： 所有觀察結(jié)果均經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，根

7、據(jù)方差齊性(Homoscedasticity)檢驗(yàn)結(jié)果，決定采用 t 檢驗(yàn)或 t′檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)比較。 結(jié)果： 1．通過建立大鼠燙傷模型并治療，觀察結(jié)果顯示：LTT蛋白治療組較燙傷1、燙傷2號(hào)和PBS治療組創(chuàng)面愈合好、且愈合速度快。說明經(jīng)過純化的LTT蛋白有一定的抗炎功能，蛋白活性存在，可進(jìn)行下一步的研究。 2．LTT蛋白在豚鼠變應(yīng)性鼻炎中的作用癥狀觀察顯示：模型組及模型對(duì)照組，從第二次激發(fā)起除模型對(duì)照組的各組豚鼠

8、抓鼻、打噴嚏癥狀較明顯。模型組動(dòng)物每次抓鼻及打噴嚏多呈連續(xù)性，模型對(duì)照組為非連續(xù)性。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物較煩躁，抓鼻及打噴嚏癥狀明顯較對(duì)照組多，并分別達(dá)到極顯著差異和顯著差異水平：抓鼻次數(shù)：模型對(duì)照組5.44±2.44，模型組13.73±5.04，P=0.000；打噴嚏：模型對(duì)照組9.67±3.39，模型組18.73±12.42，P=0.039。病理學(xué)觀察顯示：模型對(duì)照組豚鼠鼻黏膜上皮完整，無糜爛，黏膜固有層無腺體增生及嗜酸性粒

9、細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)正常鼻黏膜形態(tài)。模型組鼻黏膜水腫、增厚，上皮有鱗化，黏膜層見大量以嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，腺體增生明顯。對(duì)各治療組，我們觀察治療第4至第9天癥狀顯示：治療高低劑量組較治療空白對(duì)照組癥狀明顯減少，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。抓鼻次數(shù)：治療高劑量組3.73±1.95，治療低劑量組4.25±2.63，治療對(duì)照組10.50±1.96；打噴嚏次數(shù)：治療高劑量組6.27±4.27，治療低劑量組7.25±

10、3.39，治療對(duì)照組14.10±2.60。病理學(xué)觀察顯示：假治療組黏膜上皮完整無脫落，但伴有鱗狀上皮化生，粘膜內(nèi)見大量嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，腺體明顯增生。治療高低劑量組粘膜鱗狀上皮化生明顯改善，粘膜內(nèi)少量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴漿細(xì)胞浸潤，腺體增生不明顯。 結(jié)論： 1．以O(shè)VA為致敏原的豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型建立成功； 2．將泛過敏原與白介素IL-10偶聯(lián)在一起的新型治療性免疫疫苗LTT，以單一劑量用于治療變應(yīng)性鼻炎，