DNA疫苗載體優(yōu)化設(shè)計和新型佐劑的研究.pdf

1、DNA疫苗作為一種新型疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，同時能誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫，而且抗原編碼的“裸”DNA具有相對安全、穩(wěn)定、生產(chǎn)方便和在體內(nèi)能介導(dǎo)抗原的長期表達等優(yōu)點。但是由于免疫原性相對較弱，目前DNA疫苗的發(fā)展仍然受到很大的限制。 提高抗原基因的表達對提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用，抗原基因的優(yōu)化策略包括：對質(zhì)粒載體骨架調(diào)控元件的優(yōu)化和利用宿主基因的偏好對密碼子進行優(yōu)化等。目前常利用人巨細胞病毒(hCMV)第

2、一內(nèi)含子(IntronA)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，與hCMV啟動子/增強子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失內(nèi)含子的目的基因的表達。有文獻報道，乙肝病毒(HBV)/旱獺肝炎病毒(WHV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(H/WPRE)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)組成性轉(zhuǎn)運元件(CTE)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)pre—mRNA加工增強元件(PPE)都能通過提高mRNA的穩(wěn)定性、3’末端的加工、促進mRNA出細胞

3、核和細胞質(zhì)中mRNA的積累來增強未經(jīng)剪接的基因表達。但是這類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件是否能替代hCMVintronA或與其產(chǎn)生協(xié)同作用，從而提高DNA疫苗免疫原性還有待進行研究。 本研究首先通過刪除pVR1012質(zhì)粒載體hCMVIE intronA，構(gòu)建內(nèi)含子缺失的質(zhì)粒載體pCMV，然后將HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分別克隆入pVR1012和pCMV，獲得了pIn—HPRE、pIn—WPRE、pIn—CTE、pIn-PPE和pH

4、PRE、pWPRE、pCTE、pPPE載體。為比較hCMV IE intronA與HPRE、WPRE、CTE、PPE元件對目的基因表達的調(diào)控，將luciferase報告基因分別克隆入上述載體，體外瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞。實驗結(jié)果表明，與pVR1012載體相比pIn—HPRE和pIn—WPRE能顯著增強體外luciferase基因的表達，而pHPRE、pWPRE與pVR1012無差別。為比較HPRE、WPRE元件在hCMV IE intro

5、nA存在和缺失的情況下，對體外抗原基因表達及體內(nèi)抗原特異的免疫反應(yīng)增強效果的差異，將野生型或密碼子優(yōu)化型的HIV—1B’/C重組亞型CN54株Gag基因克隆入攜帶HPRE、WPRE元件的pVR1012和pCMV的載體，體外瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞和免疫Balb/C小鼠進行比較。實驗結(jié)果表明，PRE元件能夠顯著地提高野生型Gag基因在293T細胞中的表達，其中當(dāng)hCMV IE intronA和HPRE元件在載體上同時出現(xiàn)的時候基因的表達水平最

6、高，而且pInHGagw(+intronA/+HPRE)在10μg劑量誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)水平高于pGagw(—intronA/—HPRE)以及pInGagw(+intronA/—HPRE)在40μg劑量所誘導(dǎo)的水平。雖然載體優(yōu)化對提高體外和體內(nèi)密碼子優(yōu)化型抗原基因表達作用不太明顯，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如果載體經(jīng)hCMVIE intronA和HPRE元件的優(yōu)化，那么即使攜帶野生型基因的載體也能達到與等量的密碼子優(yōu)化GagDNA疫苗體外抗原基因表

7、達和體內(nèi)免疫原性相同的水平。 大量的實驗證明佐劑能夠增強DNA疫苗的免疫原性?？ń榫募毎诠羌苡煞种Ь?、阿拉伯半乳糖、肽聚糖組成，能激活至少五種Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9)，同時BCG中富含有免疫調(diào)節(jié)作用的CpG基序，因此它被認為是強有效的非特異免疫刺激劑，并在許多疫苗研究中得以使用。卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)是經(jīng)熱酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫調(diào)節(jié)劑，在臨床上已經(jīng)被成功地運用于

8、免疫失調(diào)或免疫水平下降及過敏性疾病的治療。本研究選擇卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作為佐劑，評價了在不同劑量、不同免疫次數(shù)下BCG-PSN對pDRVI1.0gp1455M(HIV—1 CN54 gp145基因)DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫，細胞免疫以及長期免疫記憶的增強作用。實驗結(jié)果表明，BCG-PSN和DNA疫苗質(zhì)粒混合后注射，能顯著地提高DNA疫苗的免疫原性。并且BCG-PSN的使用能夠減少DNA疫苗的免疫次數(shù)，降低DNA疫苗的用量。