疫苗佐劑BCG-CpG-DNA的斑馬魚毒性評價.pdf

1、本研究的佐劑BCG-CpG-DNA是中國食品藥品檢定研究院自主研發(fā)，其主要成分是含有少量的蛋白和多糖的核酸（分子量在3000至15710bp之間的雙鏈DNA），其中BCG-CpG-DNA濃度大約是多糖濃度的7倍，蛋白的150倍，并含有較多的非甲基化的CpG位點。由于CpG-DNA既有增強細(xì)胞免疫的刺激作用，又有增強體液免疫的刺激作用，在生物體內(nèi)主要激發(fā)Th1型免疫模式應(yīng)答，可作為新型人用疫苗免疫候選佐劑，但作為人用疫苗佐劑仍未應(yīng)用于臨床

2、。然而，在疫苗的研發(fā)和臨床實驗中，對疫苗佐劑進行安全評價是必不可少的。特別在對一種新型的免疫佐劑缺乏理化性質(zhì)、相關(guān)毒理學(xué)、相關(guān)免疫學(xué)研究和結(jié)論時，需要對疫苗佐劑開展一系列的臨床前研究和評價，研究和評價應(yīng)該涉及急毒實驗、慢毒實驗、單因子刺激和相關(guān)免疫學(xué)實驗等。本實驗旨在利用模式動物斑馬魚初步評價CpG-DNA的毒性，為佐劑的安全性提供一些基礎(chǔ)的實驗支持;為CpG-DNA的應(yīng)用和推廣以及疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)，進而為人類健康，抵御有害微生物

3、侵襲起到一定的積極作用。免疫佐劑的安全問題是一個非常關(guān)鍵的問題，在重視的同時又很容易被忽視。因為佐劑本身具有的免疫學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可能會對疫苗免疫反應(yīng)造成一定的困擾，甚至?xí)ぐl(fā)一些安全性問題。有鑒于此，必須對免疫佐劑進行一系列的安全性研究和評估。
　　 本研究以斑馬魚作為模式生物，斑馬魚胚胎為實驗材料，利用疫苗佐劑CpG設(shè)置0.15，1.5，15 and75 mg/L4個劑量組暴露斑馬魚，并以TMT作為陽性對照，從胚胎期6 hp

4、f后開始暴毒實驗，研究其對斑馬魚發(fā)育、遺傳、免疫以及行為毒性影響，每組做3個重復(fù)，實驗重復(fù)三次。結(jié)果顯示，CpG梯度劑量組與EM對照組無致死效應(yīng)，孵化率、存活率以及死亡率CpG梯度劑量組與EM對照組無顯著差異。TMT陽性對照組在胚胎中主要致畸效應(yīng)為心胞腫大，TMT降低了斑馬魚胚胎的心率和孵化率，且對斑馬魚胚胎的自主運動、觸摸運動都有影響，CpG梯度劑量組與EM對照組無顯著差異，說明CpG無明顯的發(fā)育毒性。行為學(xué)研究中，光刺激測試結(jié)果顯示

5、，胚胎自6hpf染毒至96hpf,96hpf后脫毒的斑馬魚仔魚，第5天的光刺激刺激測試中，TMT組光暗交替時，魚體放映速度明顯上升，CpG梯度劑量組與EM對照組沒有顯著差異，結(jié)果說明TMT在斑馬魚胚胎中有發(fā)育和潛在的神經(jīng)毒性，CpG無顯著影響效應(yīng)但是也無保護作用。TMT刺激斑馬魚的免疫系統(tǒng)，激發(fā)起免疫反應(yīng)，其免疫熒光相對強度增強，CpG梯度劑量組與EM對照組無顯著差異，結(jié)果說明單一的CpG佐劑不具備激發(fā)免疫反應(yīng)的效應(yīng)。
　　 總

6、之，TMT低劑量暴露對斑馬魚生長、發(fā)育、免疫及其神經(jīng)等均有不同程度的影響，導(dǎo)致心胞腫大，對光暗刺激反應(yīng)敏感。CpG組未觀察到明顯的畸形和死亡情況，其自主運動、觸摸運動、行為檢測、免疫強度檢測與EM對照組均無明顯差別。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA暴露對斑馬魚生長、發(fā)育、免疫及其神經(jīng)均無明顯的毒性作用，在斑馬魚的胚胎暴露中具有較好的安全性。鑒于人類與魚類免疫機制差異性，不能單純地從魚類毒理實驗直接推演至人類毒理機制。仍需進一步深入BCG