手足口病新型疫苗的初步研究.pdf

1、手足口病(Hand，foot and mougth diseflse，HFMD)是由腸道病毒感染引起的一種病毒性疾病，主要病原體為新腸道病毒71型(Enlerovirus 71，EV71)和柯薩奇A16型(Coxsadde A16，CA16)，EV71感染常常引發(fā)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病并發(fā)癥，CA16是引起心肌炎和心包炎等疾病的主要病原體。目前尚無有效治療HFMD的藥物，疫苗成為防控HFMD暴發(fā)最有效的手段之一，因此，研發(fā)安全、有效的H

2、FMD疫苗勢在必行。
　　 本文采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)克隆EV71(中國安徽阜陽株Cenbank-FJ607337)VP1和cA16(中國山東株Genbank-CRQ253390)VP1基因，構(gòu)建重組pFastBac HT A-EV71 VP1、pFastBac HT A-CA16 VP1和pFastBac HTB-Mel-EV71 VP1-CA16 VP1質(zhì)粒，將各重鯉質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞(DH10)，獲得各重

3、組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染至昆蟲細胞(Sf9)，應(yīng)用桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)(Bacteriumto Baculovirus，Bac-to-Bac)表達或分泌表達各重組蛋白，采用Ni抖離子親和層析柱純化各重組病毒表達產(chǎn)物；依據(jù)昆蟲細胞偏愛密碼子優(yōu)化EV7l Pl和EVTl 3cD基因克隆至表達載體pFastBac Dual多角體蛋白啟動子pPh和pP10上，構(gòu)建重組pFastBacDual EV71 P1-3CD質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與Bacmi

4、d同源重組，轉(zhuǎn)染Sf9，在Bac-to-Bac系統(tǒng)中利用病毒編碼蛋白酶3cD切割核衣殼病毒結(jié)構(gòu)蛋白P1，組裝并用蔗糖密度梯度離心純化EV71病毒樣顆粒(Virus Like Particles，VLPs)；經(jīng)免疫細胞化學(xué)法證實各目的蛋白在Sf9中的表達；將制備的重組單價蛋白疫苗，腹腔、滴鼻免疫Balb／c小鼠，檢測免疫應(yīng)答水平，取得如下結(jié)果：
　　 1所克隆的各DNA片段均與Geabaak中的相應(yīng)DNA序列一致，重組EV7lVP

5、l、CA16 VP1蛋白在Sf9中均獲得表達，得到純化重維蛋白濃度分別為0．318mg/mL和0．412mg／mL，純度均>90％。
　　 2重組EV71 VP1和CA16 VP1單價蛋白最佳抗原免疫劑量均為20μg；腹腔注射組中，小鼠血清特異性IgG抗體效價分別為875 43和1588．95，中和抗體效價分別為282．84和250．00，抗體亞型分布均以IgGl和IgG2b為主；CD4+/CD8+比值與對照組差異顯著(P<0．

6、05)，小鼠T淋巴細胞增殖雛力增強，脾細胞IL-4分泌數(shù)量>IFN-γ分泌數(shù)量(P<0．05)；鼻腔和小腸灌洗液sIgA抗體與PBS組差異不顯著著(p>0．05)；重組單價蛋白疫苗均可激發(fā)一定水平的體液免疫和細胞免疫，不能誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答，以體液免疫應(yīng)答為主。
　　 3.滴鼻免疫E3／71VP1組和CA16VP1組血清IgG效價分別為278．54和211.66，鼻腔灌洗液虹gA抗體分別為64.31和54.22，小腸灌洗液sIgA

7、抗體分別為15．98和13.55，脾細胞中sIgA-ASCs數(shù)量增多，重組單價蛋白疫苗可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和一定水平的粘膜免疫應(yīng)答。
　　 4利用Bac-to-Bac系統(tǒng)分泌表達了EV71 VP1-CA16VP1融合蛋白，得到純化重組蛋白濃度為0.516mg／mL，純度>90％。
　　 5經(jīng)昆蟲密碼子優(yōu)化的EV71 P1和EV71 3CD基因，利用Bac-to-Bao系統(tǒng)成功組裝了EV71 VLPs，純化了EV71 VLP