空腸彎曲菌多價DNA疫苗的實驗研究.pdf

1、目前，空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，C．jejuni)感染已成為全球范圍內急性胃腸炎最常見的病因之一。更具嚴重后果的是該菌與格林一巴利綜合征(Guillain-Barr~syndrome，GBS)有非常密切的關系，是導致GBS發(fā)生的重要前驅感染原。但是，由于目前對C．jejuni的遺傳學特性、毒力因子、致病作用和C．jejuni誘發(fā)GBS的機制尚不完全明了，至今仍缺少有效而可行措施來預防C．jejuni腹瀉和GBS

2、的發(fā)生。為此，本研究針對C．jejuni是一種多變、易變的腸道感染細菌，利用DNA疫苗誘導特異性體液免疫、細胞免疫的優(yōu)勢和殼聚糖增強粘膜吸收、緩釋等特性，設計制備了具有高效粘膜免疫應答的C．jejuni多價DNA疫苗。并探討其在小鼠體內誘導特異性免疫應答的效應和在小鼠C．jejuni攻擊模型中的免疫保護力，以及其在應用中的周圍神經安全性問題。為深入開發(fā)新型C．jejuni疫苗奠定理論基礎。課題分四部分： 第一部分 空腸彎曲菌多價

3、DNA疫苗的構建及其表達 目的：利用基因工程技術分別構建C．jejunicadF和peblA基因的真核表達重組質粒，并以此重組質粒DNA為核心，通過殼聚糖包裹DNA，構建C．jejuni多價DNA疫苗。并評價殼聚糖作為DNA疫苗遞呈系統(tǒng)，其促進DNA疫苗在真核細胞中表達的有效性和安全性。 方法：(1)重組質粒的構建與鑒定：分別以C．jejuniHS：2、‘HS：8、HS：19和HS：21的基因組DNA為模板，進行PCR擴

4、增，獲得四種血清型的cadF和peblA基因DNA片段，并測序比較HS：2和HS：19peblA基因的同源性。在此基礎上，選擇與GBS最為相關的C．jejuniHS：19cadF和peblA基因PCR純化產物為目的基因DNA片段，分別定向插入真核表達載體pcDNA3．1(+)，以構建pcDNA3．1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA重組質粒。重組質粒經雙酶切鑒定、PCR鑒定和DNA雙向測序確認。(2)重組質粒在COS-

5、7細胞中表達：以重組質粒DNA為核心，分別采用殼聚糖和PolyFect轉染試劑包裹DNA，制備殼聚糖-DNA和PolyFect-DNA，轉染COS-7細胞，RT-PCR方法檢測其瞬時表達，ELISA檢測其在COS-7細胞中的表達產物。(3)MTT法檢測殼聚糖-DNA的細胞毒性。 結果：(1)PCR反應顯示四種血清型C．jejuni的cadF和peblA基因DNA片段大小一致，DNA雙向測序證實C．jejuniHS：19peblA

6、基因序列與HS：2peblA基因序列具有高度同源性。所構建的重組質粒分別經雙酶切和PCR鑒定，以及DNA雙向測序證實目的基因插入成功。(2)采用RT-PCR方法能夠從重組質粒轉染的COS-7細胞中擴增出與目的基因大小一致的DNA片段。ELISA分析表明在COS一7細胞培養(yǎng)上清中可獲得目的基因表達產物。并且，殼聚糖一DNA組與PolyFect-DNA組相比較，其轉染效率和表達水平更高，轉染后3d，其表達水平增高了5．1倍，PolyFect

7、-DNA組僅增高了2．9倍(P<0．01)。(3)MTT法檢測顯示，殼聚糖-DNA組與PolyFect-DNA組相比較，其轉染細胞存活率更高，轉染后3d，殼聚糖-DNA組90％左右的細胞生長良好、形態(tài)正常，而PolyFect-DNA組細胞的存活率降至65％左右(P<0．01)。 結論：(1)C．jejunicadF和peblA基因具有高度的保守性，以此成功構建的pcDNA3．1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA

8、重組質粒均能在COS-7細胞中有效表達。(2)殼聚糖-DNA遞呈系統(tǒng)是安全、高效的DNA疫苗遞呈系統(tǒng)。 第二部分 目的：評價Cjejuni多價DNA疫苗經粘膜免疫后，誘導特異性體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應答的效應。 方法：(1)378只6周BALB／c小鼠被分為9個大組，每組42只小鼠。于實驗開始的0、7、14和2l天，以未干預組、pcDNA3．1(+)組和殼聚糖組為對照，分別將不同效價的C．jejuniDNA

9、疫苗滴鼻免疫小鼠，包括：pcDNA3。1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA(單抗原裸DNA疫苗)、pcDNA3．1(+)一cadF+pcDNA3．1(+)一peblA(雙抗原裸DNA疫苗)、殼聚糖-pcDNA3．1(+)一cadF和殼聚糖-pcDNA3．1(+)一peblA(殼聚糖一單抗原DNA疫苗)，以及殼聚糖-pcDNA3．1(+)一cadF+pcDNA3．1(+)一peblA(殼聚糖一雙抗原DNA疫苗)。(2)流

10、式細胞計量儀檢測末次免疫后4周小鼠外周血CD4+、CD8+T細胞分類情況。(3)ELISA檢測末次免疫后2、4、6和8周小鼠血清中細胞因子IFN-7、IL-4和特異性抗體IgA、IgG、IgM水平，以及小鼠糞便中IgA抗體水平。(4)末次免疫后8周各組隨機抽取6只小鼠，取其小腸組織行免疫組織化學檢查，以觀察小鼠腸壁SIgA的變化。 結果：(1)各實驗組與各對照組相比較：①末次免疫后4周，各實驗組小鼠外周血CD4+、CDs+T細胞

11、數(shù)有顯著性升高(P<0．01)；②末次免疫后2、4、6和8周，小鼠血清中IFN-~、IL-4和IgA、IgG、Igm水平，以及糞便中IgA水平，與對照組相比較均存在顯著性差異(P<0．01)，各對照組小鼠血清中上述各項參數(shù)一直無變化。各實驗組小鼠血清IFN-7、IL-4、IgA、IgG、IgM和糞便IgA水平均從免疫后2周開始上升，4周達頂峰，到第6周和8周時殼聚糖-DNA疫苗組維持在較高的水平(IgM抗體除外)，而裸DNA疫苗組則迅速

12、下降；③末次免疫后8周，腸壁SIgA免疫組化染色顯示，各實驗組小鼠其小腸粘膜固有層可見不同程度的棕色顆粒沉著，呈(+)～(+++)反應，而各對照組僅表現(xiàn)為(-)～(土)反應。(2)對應時期各實驗組相比較，上述各項指標均以殼聚糖．雙抗原DNA疫苗組為最高，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之，單抗原裸DNA疫苗組最低(P<0．01)。但是，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組間比較和單抗原裸DNA疫苗組間比較均無顯著性差異(P>0．05)。 結論

13、：C．jejuni多價DNA疫苗經鼻免疫小鼠后，能在小鼠體內激發(fā)顯著而持久的特異性體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應答。 第三部分 空腸彎曲茵多價DNA疫苗的免疫保護性研究 目的：探討C．jejuni多價DNA疫苗在小鼠C．jejuni攻擊模型中的免疫保護力，測試該疫苗的實際有效性。 方法：(1)末次免疫后第8周，分別采用HS：l9或HS：2單次和HS：19重復攻擊的方式進行C．jejuni不同嚴重度的灌胃攻擊。(

14、2)實施C．jejuni攻擊后，對各種C．jejuniDNA疫苗的免疫保護作用進行比較性評價，包括觀測疾病指數(shù)以判斷疫苗的臨床保護效率；大便培養(yǎng)以判斷疫苗對C．jejuni腸道定植的清除效應；肝組織勻漿培養(yǎng)以評價疫苗阻止C．jejuni感染向腸道外擴散的效力。(3)C．jejuniHS：19末次重復攻擊后第4周，各組隨機抽取6只小鼠取其小腸組織，行免疫組織化學檢查，以觀察腸壁SIgA的同步改變。(4)C．jejuni末次攻擊后第4周和1

15、2周，取其坐骨神經分別用于原纖維分離檢查、半薄切片光鏡檢查和超薄切片電鏡檢查以觀察疫苗阻止C．jejuni感染誘發(fā)周圍神經免疫損傷的效力。并取其小腸和肝臟組織進行H&E染色組織病理學檢查。 結果：(1)C0ejuni攻擊后引起對照組小鼠明顯組織病理學異常，包括：①小腸組織不同程度的充血水腫、炎性細胞浸潤；②肝臟組織顯示細胞質疏松、氣球樣變性、點狀壞死和灶性壞死，并伴有炎性細胞浸潤；③坐骨神經組織發(fā)生以軸索變性為主的免疫性損傷。(

16、2)各實驗組和各對照組在C．jejuniHS：19重復攻擊時，其疾病指數(shù)、C．jejuni腸道定植率、C．jejuni腸道外(肝臟)感染擴散率和受檢器官病變發(fā)生率均顯著高于HS：19或HS：2單次攻擊(P<0．01)；HS：19單次攻擊時，其坐骨神經病變發(fā)生率又明顯高于HS：2單次攻擊(P<0．01)。(3)與對照組相比，各C．jejuniDNA疫苗均能不同程度地保護免疫后小鼠免遭C．jejuniHS：19重復攻擊和HS：2的感染攻擊，

17、明顯減少C．jeiuni的腸道定植率，有效防止C．jejuni的血行擴散，顯著降低受攻擊小鼠的疾病指數(shù)和受檢器官病變發(fā)生率(P<0．01)。其中，殼聚糖一雙抗原DNA疫苗組的免疫保護作用最強，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之，單抗原裸DNA疫苗組最低。(4)C．jejuniHS：19重復攻擊后第4周，免疫組織化學檢測顯示小鼠腸壁SIgA呈同步性改變。 結論：(1)C．jejuni重復攻擊比單次攻擊具有更強的感染致病力，可作為C．j

18、ejuni對被免疫動物強化攻擊的有效模型。C．jejuniHS：19比HS：2具有更高的致周圍神經免疫性損傷的危險性。(2)C．iejuni多價DNA疫苗滴鼻免疫小鼠后，能在小鼠體內激發(fā)顯著而有效的特異性免疫應答，有效地保護免疫后小鼠抵御C．jejuni重復感染攻擊，明顯減少該菌在宿主腸道定植和腸道外擴散，顯著降低被攻擊小鼠疾病指數(shù)，并伴有腸壁SIgA同步性分泌增多。(3)C．jejuni多價DNA疫苗在有效抵御C．jejuni腸道感染