新型肝片吸蟲多表位疫苗的研究.pdf

1、本課題組依據(jù)機(jī)體對肝片吸蟲的免疫保護(hù)機(jī)制和表位疫苗的構(gòu)建理論，合理選擇肝片吸蟲鞘脂激活樣蛋白2（FhSAP-2）的Th和B細(xì)胞抗原表位，結(jié)合生物信息學(xué)軟件的分析，設(shè)計出一個結(jié)構(gòu)新穎的多表位疫苗CTB-SAPE、兩個單表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。進(jìn)一步通過基因克隆、表達(dá)及蛋白純化等技術(shù)，獲得該疫苗的重組蛋白，繼而利用免疫學(xué)實驗鑒定了多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特異性。實驗方法及結(jié)果簡述如下：
　　1、肝片吸蟲鞘

2、脂激活蛋白樣蛋白2(FhSAP-2)的原核表達(dá)及分離純化
　　生物信息學(xué)軟件OptimumTM Codon優(yōu)化密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、最優(yōu)密碼子頻率（FOP）及GC含量以獲得適合大腸桿菌BL-21表達(dá)的FhSAP-2基因序列，并克隆到原核表達(dá)載體pET22b和pET28a中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)并經(jīng)親和層析及離子交換色譜純化后獲得目的蛋白。結(jié)果OptimumTM Codon獲得優(yōu)化后的FhSAP-2序列，經(jīng)測序及酶切鑒定結(jié)果表明

3、重組質(zhì)粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2構(gòu)建成功，進(jìn)一步實驗結(jié)果表明FhSAP-2在pET28a中包涵體部位表達(dá)，可溶部位不表達(dá)；在pET22b中可溶部位表達(dá)量低，包涵體部位無表達(dá)。繼而經(jīng)Ni-NTA柱親和純化及離子交換色譜純化獲得電泳純的FhSAP-2蛋白。
　　2、多表位疫苗CTB-SAPE的設(shè)計及重組表達(dá)載體的構(gòu)建
　　本課題組在前期文獻(xiàn)調(diào)研基礎(chǔ)上合理選擇FhSAP-2優(yōu)勢B和Th細(xì)胞抗原表位

4、，通過表位疫苗的構(gòu)建理論和生物信息學(xué)分析，對FhSAP-2抗原表位的連接順序、間隔序列（Linker）和表位拷貝數(shù)，加以分析和確定，為了更好地激活粘膜免疫，在疫苗的設(shè)計中引入了分子內(nèi)佐劑CTB，最終設(shè)計出具有科學(xué)合理結(jié)構(gòu)的肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計兩個單表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。利用酶切和PCR技術(shù)構(gòu)建了重組表達(dá)載體pETCTB-SAPE、pETCTB-S1和pETCTB-S2，并將其轉(zhuǎn)入BL21（D

5、E3）大腸桿菌中。實驗結(jié)果表明：重組表達(dá)載體pETCTB-SAPE、pETCTB-S1和pETCTB-S2與設(shè)計序列完全一致。
　　3、新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的表達(dá)與純化
　　本研究誘導(dǎo)表達(dá)各個肝片吸蟲表位疫苗抗原蛋白CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2并經(jīng) Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。實驗結(jié)果表明：CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2均可獲得高效表達(dá)，并且主要以包涵體形式表達(dá)；經(jīng)Ni-

6、NTA親和層析純化后得到電泳純的CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2，為肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特異性研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　4、新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE免疫原性和免疫特異性的研究
　　本研究通過分子生物學(xué)和免疫學(xué)等方法來鑒定肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE中各個抗原表位是否保持有其免疫原性和免疫特異性、分子內(nèi)黏膜佐劑CTB組分與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合活性、肝片吸蟲多表位肽疫