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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建人生存素(survivin)的多表位真核表達載體,觀察荷載人生存素的多表位樹突狀細胞疫苗的抗乳腺癌活性。
方法:人工合成含4個survivin的HLA-A2類限制性CD8+CTL細胞表位和一個CD4+Th細胞表位的重組cDNA片段及含4個CD8+CTL細胞表位的重組cDNA片段。構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pPIRESneo3.0-survivin(4)/Th及pPIRESneo3.0-survivin(4),酶切鑒定、
2、測序分析。外周血分離培養(yǎng)人樹突狀細胞(Dendritic,DC)和T淋巴細胞,運用流式細胞儀分別檢測DC表面CD83、CD86、T淋巴細胞表面CD4、CD8a表達情況。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HLA-A2陽性的人DC,制備DC疫苗。DC疫苗與T淋巴細胞共培養(yǎng)后,ELISA法檢測上清中IFN-γ的含量。效應T淋巴細胞與靶細胞共培養(yǎng)后,四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測DC疫苗誘導的CTL對靶細胞的抑制率;流式細胞儀檢測DC疫苗作用后靶細胞的凋亡情況
3、。
結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定和測序分析,成功構(gòu)建了pPIRESneo3.0-survivin(4)/Th和pPIRESneo3.0-survivin(4)重組真核表達質(zhì)粒,流式細胞儀顯示人DC高表達CD83、CD86;人外周血T淋巴細胞高表達CD4、CD8a;survivin(4)/Th組的IFN-γ的含量(66.50±3.34pg/ml),明顯高于survivin(4)組(46.10±1.35pg/ml)、空質(zhì)粒組(25.17±
4、0.32pg/ml)、未轉(zhuǎn)染DC與T細胞共培養(yǎng)組(25.47±0.95pg/ml)和單獨T淋巴細胞組(23.73±0.50pg/ml),P<0.05。survivin(4)/Th組的MCF-7細胞的抑制率明顯高于survivin(4)組、空質(zhì)粒組、未轉(zhuǎn)染DC與T細胞共培養(yǎng)組和單獨T淋巴細胞組,P<0.05;各組效應細胞對EC-304細胞無明顯的抑制作用。DC疫苗作用后survivin(4)/Th組的MCF-7細胞的凋亡率(10.63±0
5、.29%)高于survivin(4)組(6.48±0.41%),P<0.05;亦明顯高于空質(zhì)粒組(3.74±1.04%)、未轉(zhuǎn)染DC與T細胞共培養(yǎng)組(3.32±0.98)和單獨T淋巴細胞組(3.74±1.01%),P<0.05。DC疫苗作用后EC-304細胞各組凋亡率與MCF-7細胞的空質(zhì)粒組和單獨T淋巴細胞組相近,差異無顯著性(P>0.05)。
結(jié)論:成功地構(gòu)建了含有survivin的多表位真核表達載體,荷載多個surv
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