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文檔簡介
1、人生長抑素受體2亞型(hSSTR2)是生長抑素受體家族中介導生長抑素(SS)作用最重要的亞型,通常分布在正常細胞和神經內分泌腫瘤細胞表面。研究表明乳腺癌細胞膜亦有SSTRs的表達,但其表達豐度較低,可能與對生長抑素敏感性較差有關,上調SSTR2的表達能否揮抑制乳腺癌細胞的增殖有待探索。本研究構建了含hSSTR2基因的載體,轉染MCF-7細胞,觀察對乳腺癌細胞株MCF-7增殖與凋亡的影響,為以hSSTR2為靶點的乳腺癌治療研究提供新思路。
2、
一、編碼人生長抑素受體2亞型的真核表達載體pSIG的構建與表達鑒定
借助PCR技術擴增獲得hSSTR2全長基因序列,插入真核表達載體pIRES2-EGFP中,構建重組質粒pIRES2-EGFP/hSSTR2(pSIG)。菌落PCR、酶切鑒定及測序分析證實插入的hSSTR2 cDNA閱讀框及連接部位序列正確。Real-time PCR、流式細胞術(FCM)以及免疫熒光技術確定hSSTR2在MCF-7細胞中的表
3、達、定位。在mRNA水平,實驗組hSSTR2的表達較對照組提高了2730倍;在蛋白水平,實驗組hSSTR2表達陽性細胞百分率為49.67±1.35%,空白對照組及載體對照組僅為1.63±0.15%、2.33±0.75%。免疫熒光染色證實hSSTR2在MCF-7細胞膜上表達,EGFP表達于細胞漿中。
二、hSSTR2抑制乳腺癌細胞增殖效應的研究
在細胞培養(yǎng)體系中加入生長抑素類似物,配體與受體的結合觸發(fā)了一系列生
4、物學效應:
1.對MCF-7細胞凋亡與細胞周期的影響:碘化丙叮(PI)染色FCM檢測細胞凋亡,結果顯示實驗組為40.40±14.30%,對照組僅1.31±0.38%與10.09±6.18%;細胞周期分析顯示實驗組5.61%的細胞處于S期,而對照組分別有22.36%與32.52%的細胞處于S期,差異有顯著性(P<0.01)。
2.對MCF-7細胞EGFR表達的影響:實驗組細胞EGFR表達陽性率為64.53±10
5、.05%,對照組分別為93.01±1.92%與92.14±1.49%,有顯著性差異(P<0.01),提示hSSTR2的高表達可降低EGFR的表達。
3.對EGF抗體刺激細胞生長的影響:加入不同生理濃度的表皮生長因子(EGF)刺激細胞,計算各組細胞的生長抑制率(IR%),發(fā)現(xiàn)空白對照組IR%為0±0%,載體對照組IR%依次為28.6±7.4%、40.4±6.5%、49.5±11.4%、60.6±14.3%、54.6±10.3
6、%、42.1±9.7%。實驗組IR%依次為70.5±11.1%、70.7±7.0%、81.1±3.6%、88.5±2.7%、86.5±2.5%、79.8±4.9%。在不同EGF濃度刺激下,三組細胞生長抑制率有顯著性差異(P<0.01),提示hSSTR2的高表達可抵抗EGF刺激細胞生長的作用。
三、重組腺病毒Ad-SIG的制備及表達鑒定
將pSIG質粒中hSSTR2-IRES-EGFP基因亞克隆至穿梭載體pSh
7、uttle-CMV中,獲得pShuttle-CMV/SIG,經PmeⅠ酶切、去磷酸化后轉化含pAdEasy-1的超感受態(tài)細菌BJ5183,細菌內同源重組構建腺病毒pAdEasy-1/hSSTR2-IRES-EGFP(Ad-SIG)。將Ad-SIG轉染HEK293細胞進行重組腺病毒的包裝、擴增、純化、滴度測定。Ad-SIG重組腺病毒感染MCF-7細胞,激光共聚焦顯微鏡顯示hSSTR2在MCF-7細胞膜定位表達,Real-time PCR、
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