雌激素通過(guò)抑制P2Y-,2-受體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖作用.pdf

1、雌激素在乳腺癌的形成和發(fā)展中起重要作用，外源性雌激素可以增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，然而臨床結(jié)果顯示，雌激素替代療法在增加乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)中的作用及其預(yù)后的關(guān)系尚不明確，因而關(guān)于雌激素在乳腺癌發(fā)生，發(fā)展中的作用及生物學(xué)機(jī)制的研究非常重要。
　　 雌激素是一種脂溶性甾體激素，它可以通過(guò)激活細(xì)胞核內(nèi)受體(ERα和ERβ)，影響靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。這種作用牽涉到新蛋白的合成，需要較長(zhǎng)的潛伏期，稱為激素的基因組作用(Genomic Actio

2、ns)。另一方面，雌激素可以作用于細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)快速效應(yīng)，稱為激素的非基因組作用(Non-Genomic Actions)。另外也有證據(jù)表明，雌激素激活自身受體后，還可以通過(guò)與其它受體發(fā)生交互作用(crosstalk)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡。
　　 ATP曾被認(rèn)為僅是一種貯能、供能物質(zhì)，它還是一種細(xì)胞間信息傳遞物質(zhì)，通過(guò)激活P2X(離子通道型受體)和P2Y(G蛋白耦聯(lián)型受體)而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)，大量的研究表

3、明P2Y受體存在于各種腫瘤細(xì)胞中(乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等)，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控。在已克隆的P2Y受體中，普遍認(rèn)為P2Y1，P2Y2,P2Y11在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　 早在上世紀(jì)80年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外源性ATP可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。乳腺癌細(xì)胞自身可以分泌ATP/UTP，乳腺癌細(xì)胞中也表達(dá)P2Y2受體。該受體活化后可以通過(guò)Gq/11激活PLC途徑，最終通過(guò)誘導(dǎo)

4、內(nèi)源性Ca2+的釋放在細(xì)胞的增殖，分化及凋亡中起重要作用。以上結(jié)果說(shuō)明，ATP受體可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要的角色。但乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的P2Y受體是否參與調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)改變體內(nèi)雌激素水平時(shí)，P2X受體的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，提示雌激素對(duì)P2X受體的表達(dá)可能存在調(diào)控作用。但迄今為止，雌激素是否影響P2Y受體的表達(dá)，以及是否可以通過(guò)對(duì)ATP受體的調(diào)節(jié)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、增殖凋亡，國(guó)

5、內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 因而，本課題以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231為模型，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及免疫組織化學(xué)等方法，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討兩種細(xì)胞株中ATP受體的類型，P2Y2對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，以及P2Y2受體參與雌激素對(duì)細(xì)胞增殖的作用及其中的機(jī)制，從而為進(jìn)一步闡明雌激素對(duì)惡性腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展的作用的分子機(jī)制提供新的線索；為研制新一代的抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將對(duì)人類預(yù)防和治療腫瘤，降低腫瘤的復(fù)發(fā)率起到重要作

6、用。
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法
　　 (一)細(xì)胞增殖活力的測(cè)定
　　 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力。種于96孔板上的細(xì)胞經(jīng)過(guò)加藥處理，每孔加10μl MTT培養(yǎng)3-4h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150μlDMSO，低速振蕩10min。酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度。
　　 (二)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)
　　 種于玻片上的細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS(0.01M，pH7.4)沖洗三次。4％的多聚甲醛固定10mi

7、n,PBS沖洗三次。分別向不同的玻片上加入用抗體稀釋液稀釋的羊抗人抗體ERα(1∶50)，ERβ(1∶50)，濕盒4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗三次，每次10min；加抗體稀釋液稀釋的Cy3標(biāo)記的驢抗羊IgG抗體(1∶100)37℃孵育1h，PBS沖洗三次，每次10min；熒光顯微鏡觀察記錄。
　　 (三)細(xì)胞凋亡率的測(cè)定
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。種于12孔板中(1×105個(gè)/孔)的細(xì)胞經(jīng)加藥處理后，PBS清洗一遍

8、，0.25％的胰蛋白酶(含1mM EDTA-4Na)消化后，將細(xì)胞吹打重懸于1ml PBS中。800轉(zhuǎn)/min離心3分鐘，將細(xì)胞重懸于100μ1 annexin V結(jié)合緩沖液中。按照Alexa Fluor488 annexin V/PI試劑盒的說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行annexin V和PI雙重染色?；靹虮芄忪o置，流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡。
　　 (四)RNA提取和熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定
　　 1、細(xì)胞總RNA提取和cDNA合成<

9、br>　　 種于12孔板中(1×105個(gè)/孔)的細(xì)胞經(jīng)加藥處理后，以Trizol提取液提取總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定RNA樣品純度(OD260/OD280)。同時(shí)進(jìn)行RNA定量。提取的RNA中，每樣本取2μg在25μl體系中反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，用于實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)增P2Y2受體基因。
　　 2、熒光實(shí)時(shí)定量PCR
　　 用于擴(kuò)增P2Y2受體的引物對(duì)為TGGCTCGGCGACTGCTAAA(正義)

10、，GCATCTCGGGCAAAGCGTA(反義)。反應(yīng)條件95℃5min，95℃30sec，62.8℃25秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán)。用于擴(kuò)增β-actin的基因引物為TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(正義)，GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG(反義)。反應(yīng)條件95℃5min，95℃30see，58℃25秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán)。
　　 (五)蛋白印跡雜交分析(Western Blot)
　　

11、 預(yù)冷RIPA緩沖液裂解細(xì)胞標(biāo)本。分光光度法測(cè)定蛋白含量，每孔上樣50mg蛋白，經(jīng)10％濃度的SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。經(jīng)封閉，洗滌后分別在不同膜上加1∶800稀釋的兔抗人抗體P2Y2(42kD)，1∶800稀釋的鼠抗人抗體β-actin(43kD)，4℃過(guò)夜。分別加入1∶1000稀釋耦聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的鼠抗兔抗體和羊抗鼠抗體，室溫孵育1h后采用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，暗室曝光、壓片。
　　 二、結(jié)

12、論
　　 1.雌激素通過(guò)激活ER促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，抑制MCF-7細(xì)胞的凋亡，而且雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞的促增殖作用是通過(guò)ERα完成的。
　　 2.UTP通過(guò)激活P2Y2受體抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　 3.雌激素可以通過(guò)ERα抑制MCF-7細(xì)胞P2Y2受體的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖作用。
　　 綜上所述，雌激素可能通過(guò)作用于雌激素受體ERα，下調(diào)P2Y2受體的表達(dá)，降低P2Y2受體激活對(duì)于