miR-372抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明，乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，平均每8位成年女性中就有一位罹患乳腺癌，乳腺癌的發(fā)病率和致死率在女性惡性腫瘤中始終居首位。2014年全球女性乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占女性惡性腫瘤患者的29％和15％。雖然近年來(lái)在乳腺癌的發(fā)病機(jī)理方面已有大量的研究報(bào)道，并且有些靶點(diǎn)也已開(kāi)發(fā)靶向藥物用于臨床治療，但是療效并不樂(lè)觀，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是對(duì)乳腺癌患者的極大威脅。因此亟需進(jìn)一步深入研究和完善乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，為其診治

2、提供新策略、新思路。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性表達(dá)的單鏈短序列小RNA，長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸序列，不編碼蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在進(jìn)化上具有保守性。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。microRNA的發(fā)現(xiàn)為研究完善乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了極大的補(bǔ)充，具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題檢測(cè)了miR-372在乳腺正常上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況;成功建立穩(wěn)定高

3、表達(dá)miR-372的乳腺癌細(xì)胞株（MCF7-miR-372）;通過(guò)裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)明確了miR-372在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用;并利用生物信息學(xué)方法篩選了miR-372下游的可能靶基因，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)p62是miR-372的下游靶標(biāo)基因之一。本課題的研究成果將加深我們對(duì)乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)理的了解，為乳腺癌的早期診斷和治療提供新的線索，同時(shí)將可能為相關(guān)的新藥開(kāi)發(fā)提供重要的分子靶點(diǎn)。
　　1.目的：
　　研究miR-372在乳

4、腺癌中的作用并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　2.材料和方法：
　　2.1 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析乳腺正常上皮來(lái)源的永生化細(xì)胞株MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，T47D，Bcap-37中miR-372的表達(dá)情況。
　　2.2 利用慢病毒載體pLVX-miRNA，構(gòu)建miR-372過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pLVX-miR-372），與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝出高滴度的病毒顆粒并感染MCF-7細(xì)胞，用嘌呤霉素(puro

5、mycin)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-372的細(xì)胞株（MCF-7-miR-372）。
　　2.3 建立裸鼠皮下移植瘤模型。將BAL B/c裸鼠隨機(jī)分為兩組（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只），將MCF-7-miR-372細(xì)胞和MCF-7-vector細(xì)胞的細(xì)胞懸液分別接種于兩組裸鼠右腋皮下，從接種后第7天開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)，每周兩次測(cè)量瘤體大?。ㄗ畲蠛妥钚≈睆剑瑒?dòng)態(tài)觀察、測(cè)量并記算腫瘤體積大小及荷瘤鼠體重。在接種后第29天時(shí)用頸椎脫臼法處死裸鼠

6、，剝離移植瘤組織，稱量瘤體重量，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　2.4 利用TargetScan，miRanda二個(gè)預(yù)測(cè)軟件和GO功能富集分析方法，綜合分析相關(guān)因素，篩選出miR-372可能的下游靶點(diǎn)p62。利用蛋白免疫印跡（Western Blot實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-372前后p62蛋白水平的改變;利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-372對(duì)p62的靶向調(diào)控作用。
　　3.結(jié)果：
　　3.1 與乳腺正常上

7、皮來(lái)源的永生化細(xì)胞株MCF-10A相比，miR-372在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D、Bcap-37中的表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　3.2 成功包裝了miR-372過(guò)表達(dá)慢病毒并篩選建立穩(wěn)定高表達(dá)miR-372的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7-miR-372。
　　3.3 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MCF-7-miR-372組（實(shí)驗(yàn)組）的裸鼠體內(nèi)腫瘤體積和腫瘤重量都顯著小于MCF-7-vector組（對(duì)照組）(p＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表

8、明過(guò)表達(dá)miR-372能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。
　　3.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7-miR-372細(xì)胞中的p62蛋白水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，提示miR-372可能負(fù)向調(diào)控p62的表達(dá)。雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)miR-372能通過(guò)與p623'-UTR結(jié)合，從而抑制p62的翻譯。以上兩方面的結(jié)果表明，p62很可能是miR-372直接作用的下游靶基因。
　　4.結(jié)論：
　　4.1 miR-