基因調(diào)控研制豬圓環(huán)病毒新型疫苗的初步研究.pdf

1、根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2基因序列,設(shè)計2對特異性引物,一對用于擴(kuò)增出PCV2的全基因組序列;另一對引物用于擴(kuò)增Cap基因。
　　首先,一對引物擴(kuò)增PCV2的全基因組序列,PCR結(jié)果表明PCV2基因組全長為1767bp,命名為sh0901(GenBank登錄號GU124593.1)。將PCV2的PCR產(chǎn)物通過酶切連接構(gòu)建到pET-30a載體上,得到重組質(zhì)粒pET30a-PCV2,修改PCV2的稀有密碼子的偏愛性,將偏愛密

2、碼子改為非偏愛密碼子。將PCV2基因組685bp-843bp之間編碼氨基酸的密碼子改為非偏愛密碼子序列,命名為pET30a-PCV2-C。
　　pET30a-PCV2與pET30a-PCV2-C經(jīng)EcoRⅠ酶切純化回收,T4連接酶自體環(huán)化后,用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,培養(yǎng)72-96小時后收取病毒液并且盲傳6代,用PCR和間接免疫熒光試驗(IFA)檢測結(jié)果表明環(huán)化的PCV2基因組在細(xì)胞內(nèi)能感染復(fù)

3、制,初步在細(xì)胞水平上比較PCV2-C與PCV2毒株的增值快慢差別。我們通過遺傳改造成功獲得弱毒株P(guān)CV2-C,且獲得的弱毒株P(guān)CV2-C具有感染性。
　　另一對引物用于擴(kuò)增Cap基因,獲得一約578bp的特異性片段,將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物連到pMD18-T載體上,經(jīng)序列測定,其序列與目的基因序列一致,經(jīng)酶切后連入pET-30a載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,篩選的陽性重組質(zhì)粒pET30a-Cap和空表達(dá)載體pET30a酶切鑒定,測序正確。重組質(zhì)粒