小鼠新生期變應(yīng)原刺激對后期免疫功能的影響.pdf

1、變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis,AR)是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見疾病之一,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的根本原因尚未完全清楚。現(xiàn)有的變應(yīng)性鼻炎治療方法包括避免接觸變應(yīng)原,藥物治療和免疫治療。藥物治療只能改善臨床癥狀而無法治愈疾病,變應(yīng)原特異性免疫治療雖然是目前唯一對因治療,但其治療療程很長(3～5年),且有一定風(fēng)險,許多患者不愿接受。因此,在積極尋找變應(yīng)性鼻炎的更有效的治療方法的同時,越來越多的國內(nèi)外學(xué)者將研

2、究重點放在如何預(yù)防變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展方面。本研究基于變應(yīng)原早期暴露對免疫系統(tǒng)的影響,結(jié)合變態(tài)反應(yīng)性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎)發(fā)生的免疫學(xué)基礎(chǔ),提出假設(shè):新生期預(yù)防性接種變應(yīng)原,是否影響其成年后體內(nèi)免疫反應(yīng),即增強(qiáng)特異性Th1、Treg反應(yīng),相對削弱Th2反應(yīng),并希望為變應(yīng)性鼻炎的防治提供新的思路。
　　第一部分：從方法學(xué)上對小鼠變應(yīng)性鼻炎模型進(jìn)行研究,探討變應(yīng)性鼻炎造模方法和脾臟單個核細(xì)胞加入不同的刺激劑培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞

3、因子表達(dá)的變化。采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射及OVA生理鹽水滴鼻造成變應(yīng)性鼻炎模型(包括模型加強(qiáng)組(AR加強(qiáng)組)和一般模型組(AR組)),AR加強(qiáng)組較AR組多一次OVA腹腔注射,對照組則采用生理鹽水替代OVA。在最后一次滴鼻后5分鐘內(nèi),主要觀察噴嚏、鼻涕、搔鼻等指標(biāo),反映小鼠行為學(xué)變化;采用ELISA法檢測血清中OVA特異性IgE、IgG1、IgG2a含量的變化;在末次滴鼻后取脾臟單個核細(xì)胞培養(yǎng),并分別加入卵清蛋白(OVA)和豆蔻酰佛

4、波醇乙酯(PMA)刺激脾臟單個核細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子,于培養(yǎng)4小時后取培養(yǎng)液,采用流式細(xì)胞儀檢測脾臟單個核細(xì)胞培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-4、IFN-γ、IL-10陽性細(xì)胞百分率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗組(AR加強(qiáng)組和AR組)與對照組相比,血清中OVA特異性IgE、IgG1、IgG2a抗體均明顯增高(P<0.05)。實驗組(AR加強(qiáng)組和AR組)脾臟單個核細(xì)胞加入PMA刺激培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-4陽性細(xì)胞百分率顯著性高于對照組(P<0.0

5、5),CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ陽性細(xì)胞百分率AR加強(qiáng)組比對照組顯著降低(P<0.05),AR組與對照組無顯著性差異,IL-4/IFN-γ比值A(chǔ)R加強(qiáng)組(0.13)高于AR組(0.09),實驗組均高于對照組(0.04),而CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-10陽性細(xì)胞百分率AR組及AR加強(qiáng)組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;加入OVA刺激培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-4陽性細(xì)胞百分率AR組及AR加強(qiáng)組比對照組均顯著性增高(P<0.05),但升高幅度比加入P

6、MA的低,CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ陽性細(xì)胞百分率AR組和AR加強(qiáng)組與對照組均無統(tǒng)計學(xué)意義,IL-4/IFN-γ比值A(chǔ)R加強(qiáng)組(1.77)高于AR組(0.44),兩組均高于對照組(0.27),而CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-10陽性細(xì)胞百分率AR組較對照組顯著性升高(P<0.05),AR加強(qiáng)組與對照組無顯著性差異。不同刺激劑體外刺激單個核細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的效應(yīng)是不同的,受PMA刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子與對照組相比,差異比OVA刺激的顯著。AR加強(qiáng)組和

7、AR組血清中OVA特異性IgE及IgG1抗體均較對照組顯著增高,但AR加強(qiáng)組IL-4/IFN-γ比值高于AR組,說明AR加強(qiáng)組的Th2優(yōu)勢大于AR組,AR加強(qiáng)組的模型建立方法可能會增加Th2優(yōu)勢免疫的發(fā)生。
　　第二部分：是研究小鼠新生期暴露于變應(yīng)原對脾臟T細(xì)胞亞群發(fā)育及免疫功能的影響。在小鼠新生期,對其皮下注射不同劑量(10μg,100μg,1000μg)的OVA抗原,并輔以氫氧化鋁免疫佐劑,待其成年后致敏激發(fā),通過采用ELIS

8、A法檢測血清中OVA特異性IgE、IgG1、IgG2a含量的變化及流式細(xì)胞儀檢測單個核細(xì)胞培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-4、IFN-γ、IL-10陽性細(xì)胞百分率,觀察其成年后T細(xì)胞亞群功能的變化,以反映早期抗原接種是否影響其成年后的體內(nèi)免疫反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清中OVA特異性IgE、IgG1含量10μg劑量組、100μg劑量組與1000μg劑量組均較對照組明顯升高(P<0.5),且隨著接種抗原劑量的增大血清中OVA特異性IgE、IgG1含量

9、隨之降低;血清中OVA特異性IgG2a含量10μg劑量組、100μg劑量組與1000μg劑量組均較對照組升高,且隨著接種抗原劑量的增大血清中OVA特異性IgG2a含量隨之升高。10μg劑量組、100μg劑量組、1000μg劑量組脾臟單個核細(xì)胞加入PMA刺激培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞百分率均較對照組顯著性降低(P<0.5),10μg劑量組的CD4+T細(xì)胞中IL-4陽性細(xì)胞百分率顯著性高于對照組(P<0.5),100μg劑量組

10、和1000μg劑量組的CD4+T細(xì)胞中IL-4陽性細(xì)胞百分率也較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;IL-4/IFN-γ比值10μg劑量組(0.18)高于100μg劑量組(0.15),100μg劑量組高于1000μg劑量組(0.06),三個劑量組均高于對照組(0.03),且隨著接種抗原劑量的增加IL-4/IFN-γ比值隨之減小;CD4+T細(xì)胞中IL-10百分率無統(tǒng)計學(xué)意義。加入OVA刺激培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞中IL-4陽性細(xì)胞百分率10μg劑

11、量組顯著性高于對照組(P<0.5),但升高幅度比加入PMA的低,100μg劑量組和1000μg劑量組也較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;CD4+T細(xì)胞中IFN-γ百分率10μg劑量組、100μg劑量組、1000μg劑量組均較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;CD4+T細(xì)胞中IL-10百分率100μg劑量組顯著性高于對照組(P<0.5),10μg劑量組和1000μg劑量組較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;IL-4/IFN-γ比值10μg劑量組(0.49)高

12、于100μg劑量組(0.42),100μg劑量組高于1000μg劑量組(0.28),三個劑量組均高于對照組(0.09),且隨著接種抗原劑量的增加IL-4/IFN-γ比值隨之減小。
　　綜上所述,10μg劑量組Th2優(yōu)勢免疫顯著高于100μg、1000μg劑量組,且隨著接種抗原劑量的增加,Th2優(yōu)勢免疫逐漸減弱。說明對于新生小鼠,皮下注射100或1000μg變應(yīng)原可相對削弱Th2反應(yīng),從而對IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)起到緩解作用,對其變應(yīng)