以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤治療性腺病毒疫苗的研究.pdf

1、研究背景:轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是臨床上大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要因素。研究表明,90％以上的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。而傳統(tǒng)治療方案,無(wú)論是手術(shù)治療還是放射治療和化學(xué)治療,都難以保證將晚期或轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞徹底消滅。近年來(lái),研究人員將根治惡性腫瘤的希望寄托于腫瘤基因治療策略?，F(xiàn)在研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)是如何能夠激發(fā)機(jī)體針對(duì)特異性腫瘤抗原的更強(qiáng)并且更加有效的免疫反應(yīng)。
　　研究目的:本課題目標(biāo)是研制新型抗腫瘤腺病毒疫苗Ad5F11p

2、-eTERTFcGB,通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用,打破免疫耐受和實(shí)現(xiàn)免疫增效。
　　方法:
　　1.將前期構(gòu)建的sig-eTERT-Fc-GPI-IRES-GM/B7復(fù)合基因片段運(yùn)用分子克隆技術(shù)連入AdEasy-1/F11p改良腺病毒載體得到Ad5F11p-eTERTFcGB重組質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,獲得Ad5F11p-eTERTFcGB原代病毒。大量擴(kuò)增腺病毒,采用陰離子交換層析技術(shù)純化獲得體內(nèi)試驗(yàn)級(jí)別的腺病毒

3、產(chǎn)品。
　　2.將hTERT(538aa-875aa)基因片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-42a中,IPTG誘導(dǎo)并純化hTERT蛋白,通過(guò)WesternBlot和ELISA檢測(cè)純化后的hTERT蛋白的免疫原性。
　　3.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,共轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,經(jīng)抗生物加壓篩選出陽(yáng)性克隆,Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光檢測(cè)hTERT和Luc在B16

4、細(xì)胞中的表達(dá);將穩(wěn)定共表達(dá)hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc細(xì)胞株通過(guò)皮下注射和尾靜脈注射的方式接種C57BL/6小鼠,建立小鼠皮下荷瘤模型和腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型。
　　4.建立小鼠皮下荷瘤模型和肺部腫瘤轉(zhuǎn)移模型,抗腫瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB采用肌肉注射免疫小鼠,觀察抑瘤效果,并對(duì)其免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的研究:ELISA檢測(cè)小鼠血清中的特異抗體和細(xì)胞因子的水平;LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)

5、;ELISPOT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ的分泌;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠的脾細(xì)胞NK細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞分型;免疫熒光檢測(cè)腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD8+T;對(duì)腫瘤組織及睪丸進(jìn)行病理組織切片染色觀察腫瘤局部免疫微環(huán)境及免疫后小鼠其他組織有無(wú)免疫損傷。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了Ad5F11p-eTERTFcGB重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,成功包裝出原代腺病毒。采用QSepharoseXL陰離子交換層析技術(shù)純化獲得

6、體內(nèi)試驗(yàn)級(jí)別的腺病毒產(chǎn)品。經(jīng)驗(yàn)證Ad5F11p-eTERTFcGB重組腺病毒感染細(xì)胞后,可以很好的表達(dá)eTERTFc融合抗原、GM/CSF免疫佐劑和B7.1共刺激因子。
　　2.成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-42a-hTERT,純化出大小約為65KD的融合蛋白;WesternBlot和ELISA檢測(cè)顯示純化后的hTERT蛋白具有很好的免疫原性。
　　3.成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-

7、Luc,建立了穩(wěn)定共表達(dá)hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16單克隆細(xì)胞株B16-hTERT/Luc;成功建立了荷瘤小鼠模型。
　　4.腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB免疫后,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比疫苗組成瘤時(shí)間延長(zhǎng)6d,小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制;疫苗組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高濃度的hTERT特異性抗體;可以檢測(cè)到疫苗組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的增加,特異性的分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞達(dá)581±62SFU/106個(gè)脾淋巴細(xì)

8、胞;疫苗組淋巴細(xì)胞與對(duì)照組相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率明顯增加,在效靶比為40:1、20:1和10:1時(shí),CTL的殺傷率分別為61.4%、45.8%和35.3%。在疫苗組免疫的小鼠腫瘤組織中可以檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。小鼠體內(nèi)低量表達(dá)TERT的睪丸組織病理切片中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自身免疫性炎癥反應(yīng)和組織損傷的證據(jù)。
　　結(jié)論:構(gòu)建的新型抗腫瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB與對(duì)照組相比在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體