以氨肽酶N為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)、合成及初步活性研究.pdf

1、氨肽酶N(Aminopeptidase N)是屬于Ⅱ型鋅離子依賴性金屬蛋白酶M1家族的一類膜結(jié)合型外肽酶，以同源二聚體的形式廣泛存在于哺乳動物的腎臟及小腸的刷狀緣細(xì)胞、神經(jīng)突觸細(xì)胞等多種細(xì)胞的表面。作為一個(gè)外肽酶，APN具有廣泛的生物學(xué)功能，可水解多種底物。更引人注意的是，相比正常細(xì)胞，APN在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)，在腫瘤組織的血管新生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要的作用，被稱為腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原CD13。最近有研究表明，A

2、PN是肝癌腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，與腫瘤的復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)。因此，APN已成為抗腫瘤研究中的一個(gè)重要的靶標(biāo)。
　　目前已有的APN抑制劑可以分為天然和合成類APN抑制劑兩大類。天然APN抑制劑主要有Bestatin、 Probestin、 Phebestin、AHPA-Val、Lapstatin、Amastatin和Curcumin等;合成類抑制劑主要有:a-氨基醛類、a-氨基磷酸類、a-氨基硼酸類、β-氨基硫醇類、L-

3、異谷氨酸類、L-賴氨酸類、L-硝基精氨酸類、環(huán)酰亞胺類、以及氨基萘滿酮類等。雖然許多APN抑制劑被發(fā)現(xiàn)和合成出來，但是Bestatin仍然是目前唯一上市的APN抑制劑。制約APN抑制劑發(fā)展的主要問題是其低活性和其低選擇性:現(xiàn)有的抑制劑對APN酶活的抑制能力都較弱，IC50通常都在微摩爾水平;大部分的APN抑制劑存在選擇性差的問題，不僅能抑制APN，對LAP、APB等其它的金屬蛋白酶也有抑制作用。這就需要通過合理的藥物設(shè)計(jì)尋找和開發(fā)高選擇

4、性的強(qiáng)效APN抑制劑。
　　借助APN結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新研究成果，由APN的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)及抑制劑與其的作用模式可知一個(gè)好的APN抑制劑應(yīng)該包括四個(gè)部分:A）與S1口袋進(jìn)行疏水性作用的芳環(huán)側(cè)鏈;B）占據(jù)S1'口袋的氨基酸疏水性側(cè)鏈;C）Zn離子螯合基團(tuán)(Zinc Binding Group，ZBG); D)合適的連接基團(tuán)將它們連接起來。本論文在前期工作的基礎(chǔ)上，對先導(dǎo)物15的上述四個(gè)部分分別進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造得到了四個(gè)系列的

5、小分子類肽化合物，并對其進(jìn)行了體外抑酶實(shí)驗(yàn)、體外抗腫瘤增殖實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，以期從中篩選出具有較好抗癌活性的先導(dǎo)物。
　　本論文共設(shè)計(jì)、合成了四個(gè)系列67個(gè)目標(biāo)化合物，并對所有化合物通過核磁共振氫譜和電噴霧質(zhì)譜等方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)文獻(xiàn)查閱證實(shí)，所合成的化合物均為新型化合物，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　體外酶抑制活性實(shí)驗(yàn)顯示，在系列一中，用其它的ZBG來代替異羥肟酸引起化合物活性的大幅度降低，這說明一個(gè)合適的ZBG是化合物具有

6、較強(qiáng)APN抑制活性的先決條件;系列二中，使用不同的連接基團(tuán)如酰胺，磺酰胺等代替先導(dǎo)物中的脲基也引起活性出現(xiàn)一定程度的減弱。但是，我們發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)的鄰位引入取代基有利于化合物對APN的抑制活性;基于此結(jié)果我們設(shè)計(jì)了系列三化合物，酶活測試結(jié)果顯示苯環(huán)鄰位引入取代基使化合物的活性大幅度增加，其中化合物3b、3c的半數(shù)抑制濃度(IC50)達(dá)到了納摩爾水平;而在系列四中，我們嘗試在化合物的苯環(huán)上引入雙取代，得到了IC50低于陽性對照藥Bestati

7、n兩個(gè)數(shù)量級的化合物4a。對人卵巢癌ES-2細(xì)胞表面的APN抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與非人源APN酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說明我們的化合物對人源APN也具有很強(qiáng)的抑制活性。
　　體外抗腫瘤增殖實(shí)驗(yàn)顯示，目標(biāo)化合物對腫瘤細(xì)胞的增殖有微弱的抑制能力，這種抑制能力與化合物對APN的抑酶活性無關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)的前期工作和一些文獻(xiàn)報(bào)道相一致，說明了APN抑制劑不是依靠細(xì)胞毒性發(fā)揮抗血管新生和抗腫瘤作用。有文獻(xiàn)報(bào)道APN抑制劑與5-Fu聯(lián)用能增強(qiáng)5-Fu對腫瘤

8、的殺傷能力。因此，在這里我們也考察了化合物4a與5-Fu聯(lián)用對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目標(biāo)化合物4a能增強(qiáng)5-Fu對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制能力。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)顯示了相似的結(jié)果，單獨(dú)使用4a能部分抑制小鼠中腫瘤的生長，而與5-Fu聯(lián)用后能夠增強(qiáng)其對腫瘤的抑制能力。這可能與其抑制了腫瘤干細(xì)胞和抗腫瘤新生血管生成能力有關(guān)。
　　綜上所述，本研究基于最新解析出的人APN的晶體結(jié)構(gòu)及其抑制劑Bestatin與催化活性中心的結(jié)合模式，在前期