以G3BP為潛在靶點的新型抗腫瘤藥物研究.pdf

1、G3BP(Ras-GTPase-activatingproteinSH3domain-bindingproteins)是第一個分離得到的RasGAPSH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，具有G3BP1和G3BP2兩個亞型。G3BP在多種腫瘤組織和細胞中高表達，包括肺癌，乳腺癌，結(jié)直腸癌和頭頸部癌等。同時G3BP也參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的多條信號通路，包括Ras信號通路，NF-kappaB信號通路和泛素-酶體途徑（主要是USP10）。G3BP還與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)

2、移密切相關(guān)。G3BP1是組成應(yīng)激顆粒的重要蛋白，在應(yīng)激顆粒中，G3BP能與一些RNA結(jié)合，從而決定它們翻譯的起始和阻遏。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G3BP能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達來影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。
　　 RasGAP是Ras活性的負調(diào)控蛋白，同時又參與Ras信號的傳遞，與細胞增殖，遷移和凋亡相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)只有在增殖的細胞中才能免疫共沉淀得到G3BP與RasGAP復(fù)合物。該結(jié)果提示，當Ras處于活性狀態(tài)時，G3BP與Ra

3、sGAP結(jié)合。同樣有研究發(fā)現(xiàn)只有在生長的細胞中才能免疫共沉淀得到G3BP與RasGAP，并且依賴于Ras的活化狀態(tài)。這進一步提示G3BP可能通過GAP參與Ras活性調(diào)節(jié)，而且參與Ras的信號傳導。
　　 基于以上認識，我們認為G3BP可能是一個潛在的腫瘤治療靶點，阻斷RasGAP與G3BP的結(jié)合可能是一個新的腫瘤治療策略。
　　 1．下調(diào)G3BPs能夠抑制腫瘤細胞生長
　　 RNA干擾技術(shù)主要通過外源導入與靶基因

4、mRNA互補的雙鏈RNA，從而抑制靶基因的蛋白表達。本研究選取G3BPs表達水平較高的HCT116和H1299細胞，通過化學合成的21個核苷酸的短干擾核糖核酸(siRNA)瞬時沉默兩個細胞中G3BP的表達水平，觀察其對腫瘤細胞增殖生長的作用。我們發(fā)現(xiàn)G3BPs干擾后抑制了HCT116和H1299細胞的生長，并且引起細胞的凋亡。
　　 另外，我們構(gòu)建了G3BPs穩(wěn)定下敲的H1299/G3BPs(-)細胞株，不管是G3BPs穩(wěn)定下敲

5、的單克隆細胞株H1299/G3BPs(-)-sc，還是G3BPs穩(wěn)定下敲的多克隆細胞株H1299/G3BPs(-)-mc都顯著影響了H1299細胞的增殖和生長。
　　 2．G3BPs參與腫瘤細胞的遷移侵襲
　　 G3BPs參與腫瘤細胞的遷移侵襲。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)G3BPs后能夠降低腫瘤細胞的遷移能力和侵襲能力。我們檢測了用siRNA瞬時沉默G3BPs的腫瘤細胞或G3BPs穩(wěn)定下敲的H1299細胞株，結(jié)果腫瘤細胞的遷移侵襲能力

6、都明顯降低了。同樣我們發(fā)現(xiàn)針對G3BP設(shè)計的多肽藥物也能夠顯著的抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。G3BPs下調(diào)抑制腫瘤細胞的遷移侵襲能力與抑制FAK/ERK/NF-κB信號通路有關(guān)。
　　 3．靶向G3BP設(shè)計的多肽藥物的抗腫瘤作用
　　 RasGAPSH3結(jié)構(gòu)域與G3BP的NTF2樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，參與RasGAP的信號傳導。用計算機模擬了RasGAP與G3BPNTF2樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模型，并且認為RasGAP301-326肽段

7、與G3BP具有很強的結(jié)合能力。我們將RasGAP30l-326肽段加上十個氨基酸的穿膜肽TAT，合成了一個新的多肽藥物38GAP。在體外增殖抑制實驗中，我們用臺盼藍拒染法和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)38GAP對HCT116細胞具有明顯的增殖抑制作用，IC50為38.76μM。我們發(fā)現(xiàn)38GAP能夠引起HCT116細胞的凋亡，并且是依賴于caspase通路的。38GAP能夠抑制ERK、Akt和NF-kappaB的活性。
　　 根據(jù)上面提及的

8、計算機模擬的RasGAP與G3BPNTF2樣結(jié)構(gòu)域的相互作用模型，我們又設(shè)計了理論上與G3BP結(jié)合能力更強的全新氨基酸序列的GAP161多肽藥物。我們觀察了GAP161隨時間變化進入細胞的過程，以及與G3BP的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)GAP161在體外具有更好的增殖抑制作用，能夠誘導細胞凋亡。GAP161能夠阻斷RasGAP與G3BPs的作用，并且下調(diào)G3BPs蛋白，從而抑制Ras信號。在體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中GAP161單藥具有明顯的抑瘤作用

9、，與順鉑聯(lián)用具有顯著的協(xié)同作用。
　　 4．下調(diào)G3BPs能夠促進腫瘤細胞對化療藥物的敏感性
　　 38GAP能夠增加HCT116細胞對傳統(tǒng)化療藥物順鉑(CDDP)的敏感性。在HCT116細胞中，CDDP引起的ERK和NF-kappaB的激活能夠抵抗CDDP的細胞毒作用。38GAP與CDDP聯(lián)合后能夠抑制CDDP引起的ERK和NF-kappaB的激活，從而提高順鉑的作用。用G3BPs-siRNA處理細胞后能夠顯著提高CD

10、DP的細胞毒作用。在體內(nèi)實驗中，我們用小鼠結(jié)腸癌CT26BALB/c移植瘤模型對38GAP的抗腫瘤作用進行了評價。38GAP單藥25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg劑量組的具有一定的腫瘤抑制率，分別為15％、18％和23％。CDDP單藥1mg/kg具有38％的抑制率，兩藥聯(lián)合后的抑制率分別為41％、45％和60％。
　　 同樣，GAP161與CDDP聯(lián)用后也能夠顯著提高順鉑的細胞毒作用，并且這種增敏作用是通過抑制Ra

11、s的活性形式RasGTP以及Ras下游信號通路來實現(xiàn)的。
　　 綜上所述，G3BPs參與細胞的生長、運動和侵襲，下調(diào)G3BPs能夠降低細胞的增殖生長，引起細胞凋亡，抑制細胞的遷移侵襲能力。針對G3BP設(shè)計的多肽藥物能夠阻斷RasGAP與G3BPs的結(jié)合，同時能夠下調(diào)G3BPs蛋白，抑制Ras活性，從而能夠明顯抑制細胞增殖生長，引起細胞凋亡。下調(diào)G3BPs能夠增加細胞對化療藥物CDDP的敏感性。多肽藥物還能夠抑制腫瘤細胞的遷移和侵