以組織因子為靶點的腫瘤免疫治療結(jié)合物的制備和純化.pdf

1、研究背景和目的：
　　化學(xué)藥物治療作為惡性腫瘤治療方法中重要的一部分，與適于局限性腫瘤的外科學(xué)手術(shù)治療和放射治療有著本質(zhì)的不同，是腫瘤綜合治療的重要手段之一，盡管采用多藥聯(lián)合、大劑量化療等手段不斷改善腫瘤化療的療效，受個人耐受情況及化療藥劑量依賴性毒性的影響，化療藥物的治療效果仍受到限制，傳統(tǒng)化療藥物的治療效果似乎進(jìn)入平臺期。腫瘤靶向治療藥，能特異性的結(jié)合腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的分子結(jié)構(gòu)，具有高選擇性、低毒等傳統(tǒng)化療藥所不具有的優(yōu)點

2、，眾多腫瘤靶向治療藥物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，靶向藥物是目前腫瘤化療藥物研究的熱點之一。
　　組織因子（tissue factor，TF）從其凝血功能研究開始發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，不僅與腫瘤患者血液高凝狀態(tài)相關(guān)從而引起腫瘤患者靜脈血栓形成，其誘導(dǎo)的凝血級聯(lián)反應(yīng)及與之相關(guān)的信號途徑等機(jī)制與促進(jìn)腫瘤血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤生長有關(guān)，近年來TF與腫瘤干細(xì)胞之間聯(lián)系性的提出為腫瘤的難治、復(fù)發(fā)提供了新的線索。且在多種惡性腫瘤

3、中檢測到TF異常增高表達(dá)。
　　Hu等[1,2]設(shè)計的抗體類似物，由編碼點突變（K341A）hfVII和免疫球蛋白效應(yīng)片段（IgG1Fc）構(gòu)成的免疫結(jié)合物（Immnoconjugate，Icon）在應(yīng)用于包括黑色素瘤、前列腺癌、和乳腺癌等動物模型上時表現(xiàn)出顯著效果，使移植瘤消退，但是，動物實驗表現(xiàn)出該結(jié)合物對小鼠的凝血功能有一定影響的研究下。本研究在分析fVII晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)fVII由輕鏈和重鏈組成，輕鏈中EGF和Gla區(qū)與TF緊密

4、結(jié)合有關(guān)，而重鏈則與凝血反應(yīng)有關(guān)。且利用編碼fVII輕鏈與IgG1Fc的腺病毒載體在結(jié)直腸癌動物模型中表現(xiàn)出良好的抗血管治療作用。
　　本研究利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建hfVII-LC+IgG1Fc的真核細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入CHO-K1細(xì)胞中體外獲得hfVII-LC+IgG1Fc免疫結(jié)合物，以期減少hfVII對凝血功能的影響及腺病毒載體對肝功能的損害。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　第一部分：TF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)
　　采

5、用免疫熒光方法檢測HT-29及NB4細(xì)胞株上TF的表達(dá)情況。
　　第二部分：hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白的制備和純化
　　1、分別從健康人外周血單個核細(xì)胞和肝組織中提取總RNA。
　　2、采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增hIgG1Fc及hfVII-LC基因片段。
　　3、用BamH I、EcoR I分別雙酶切hfVII-LC PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒，T4 DNA連接酶作用下連接，然后轉(zhuǎn)化D

6、H5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選Amp抗性克隆，用PCR、雙酶切及測序方法鑒定陽性克隆pcDNA3.1（+）--hfVII-LC，用同樣的方法及EcoR I、Xho I內(nèi)切酶構(gòu)建pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc最后酶切及測序方法鑒定陽性克隆。
　　4、以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒入中國倉鼠卵巢細(xì)胞亞株 CHO-K1細(xì)胞，G418加壓篩選獲得陽性單克隆細(xì)胞，用半定量RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染是否成功。
　　5、Excell

7、302無血清擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)液Ni-NTA親和層析純化和制備hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白，純化后蛋白，BCA法測蛋白濃度。考馬斯亮藍(lán)檢測親和層析純度。
　　6、ELISA法檢測不濃度融合蛋白與TF的靶向作用。
　　第三部分：噬菌體肽庫序貫篩選TF靶向肽
　　1、分別以純化TF蛋白和具有TF高特異性表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29為靶分子，用噬菌體七肽庫進(jìn)行序貫篩選。
　　2、ELISA初步鑒定噬菌體克隆對

8、HT-29親和力。
　　3、噬菌體克隆進(jìn)行測序，利用競爭抑制 ELISA比較各合成肽的TF結(jié)合力。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　免疫熒光法檢測HT-29及NB4細(xì)胞膜呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光表達(dá)，表明有TF異常高表達(dá)，陰性對照則基本不發(fā)出熒光信號。
　　第二部分：
　　1、分別從肝組織及外周血單個核細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測的OD260/280在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，且RNA于瓊

9、脂糖電泳條帶清晰，完整。
　　2、分別以肝組織及外周血單個核細(xì)胞總RNA為模板RT-PCR方法可分別擴(kuò)增出696bp和456bp大小的兩段基因片段，測序結(jié)果符合目的基因序列。
　　3、pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　使用特異引物進(jìn)行RT-PCR，從肝組織和淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增得到目的基因片段，將其插入pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體，構(gòu)建成pcDNA3.1（+）--hfVI

10、I-LC+hIgG1Fc重組載體。經(jīng)BamH I、EcoR I和Xho I三酶切，可見約5.4kb、696bp和456bp大小的三條帶，分別為酶切后的載體片段及兩條目的片段。將 pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc陽性重組子進(jìn)行 DNA測序，測序結(jié)果與 Genebank中的hfVII-LC、hIgG1Fc序列完全吻合，且?guī)в芯幋a6×His標(biāo)簽蛋白序列。說明pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc真

11、核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　4、RT-PCR檢測hfVII-LC+hIgG1Fc mRNA的表達(dá)
　　對CHO-K1-hfVII-LC+hIgG1Fc細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出大小為456bp的hfVII-LC條帶，大小為1152bp的hfVII-LC+hIgG1Fc條帶以及GAPDH大小為327bp。在相同RT-PCR擴(kuò)增條件及加樣量下，同步轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒CHO-K1細(xì)胞無特異目的條帶。
　　5、SDS

12、-PAGE凝膠檢測通過Ni-NTA樹脂純化后蛋白的純度和分子量大小
　　收集的無血清培養(yǎng)基經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化純化后得到較純的目的蛋白分子量大小為55-70KD之間。經(jīng)western blot檢測純化后的蛋白帶有His標(biāo)簽蛋白。
　　6、ELISA檢測hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白與TF的親和力：分別檢測5個不同稀釋度0,0.01,0.1,1和10mg/mL hf-LC+hIgG1Fc與TF的結(jié)合能力，在450/6

13、30nm雙波長下分別測定其OD值：（各平行對照孔取平均值）分別為0.091±0.0012、0.283±0.0014、0.385±0.03、0.464±0.0116和0.765±0.0012（P<0.05）。OD值越高說明合成的免疫結(jié)合物與TF的結(jié)合增加，其中加入免疫復(fù)合物孔的OD值都高于未加入孔，提示免疫結(jié)合物與TF有親和力，且呈劑量依賴性。
　　第三部分：
　　1、回收率由于淘選出與 TF特異性親和性增加隨機(jī)七肽庫回收率由

14、2.25×10-4％增加到1.32×10-2%。
　　2、隨機(jī)挑選的30個陽性噬菌體克隆與HT-29細(xì)胞上TF結(jié)合活性由ELISA初步鑒定以O(shè)D值為陰性對照值（0.64）3倍以上即為陽性，其陽性率為76.7%。
　　3、按噬菌體DNA測序結(jié)果重復(fù)率高的基因序列人工合成多肽A、B、C、D、E，與抗TF抗體行ELISA競爭抑制法，分別讀取OD值換算成IC50分別為3.25nM、6.72M、3.24×103M、2.08×102 M